[發明專利]一種三維灌流式細胞培養器及其應用

有效

• 申請號: 201410024728.8
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103740591A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 胡康洪
• 申請（專利權）人: 康珞生物科技（武漢）有限公司
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于細胞培養設備或裝置領域，具體涉及一種三維灌流式細胞培養器，同時還涉及一種三維灌流式細胞培養器的用途，在三維灌流培養條件下，使新生腎皮質部位的胚胎干細胞/祖先細胞成功分化為腎小管組織的一種細胞培養器。

背景技術

自Willhelm?Roux于1885年從雞胚中分離細胞首次建立體外細胞培養，單層細胞培養技術已有百余年的歷史。一個多世紀以來，單層細胞培養有了蓬勃的發展。特別是在制藥或者疫苗合成等產業化領域，通過細胞的快速分裂，高效率地制造產品。但在生命科學基礎研究領域，對于細胞的體外培養，關注的不僅僅是它們的分裂生長，更為重要的是它們經過傳代后能否維持體內的性狀。在很多情況下，單層細胞培養技術所取得的研究結果和體內的情況不符合，因為細胞在體外改變的環境下增生，逐漸喪失了原有的性狀。動物實驗完全在體內進行，但由于體內的多種因素制約以及體內和外界環境相互影響而變得復雜化，難以研究單一過程。另外，我們在動物身上所觀察到的結果，往往是最終呈現的表現型，而非研究者最為關心的中間過程。顯然，如何填補單層細胞培養和動物實驗的鴻溝，一直是生命科學家思索的問題。尤其是在再生醫學領域，迫切需要建立一套細胞培養技術，既能生長傳代，還能最大程度地維持體內性狀，并使干細胞分化產生新的組織結構，以便替代體內因疾病損壞的組織。隨著組織工程的新興發展，三維細胞培養技術應運而生。

體外細胞培養的一個重要原則是需模擬體內細胞生長環境，該模擬系統中最重要的核心因素是細胞與培養環境之間的相互作用。不同于傳統的單層細胞培養，三維細胞培養技術是指將具有三維結構不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養，使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長，構成三維的細胞-載體復合物。三維細胞培養中，細胞外基質蛋白充當生長支架，使得細胞能夠分化產生一定的三維組織結構，所創建的細胞生長環境，需要最大程度地模擬體內環境。近幾年三維細胞培養技術在組織形成、血管發育和器官再造等領域得到了廣泛的應用；同時在篩選新藥的療效分析和毒理實驗方面，利用三維培養獲得了和二維單層培養完全不同的結果，引起了藥物學家的極大興趣。

在常規的三維細胞培養中，一般采用靜態培養的方法。仔細觀察靜態培養中的微環境，不難發現培養液的總體積數倍大于與所培植細胞真正接觸的培養液體積，這一過大的“死角體積”阻礙了細胞的分化。在靜態環境中，細胞產生的代謝廢物積累在培養腔室中，對分化有害。引入動態的灌流培養，保證持續新鮮的化學培養液以恒定的速率進入培養器內部，提供細胞分化所必須的營養和誘導因子，并及時移去代謝廢物。離開灌注培養器的培養液不再循環使用，而是通過乳膠導管被導入廢液瓶。這為分化奠定了前提。

運用脈管取代支架材料，填充在培養器內的凹槽腔中。實驗證實，和支架材料相比較，外觀海綿狀的脈管能更明顯地降低培養的“死角體積”。化學合成的脈管由約5μm截斷直徑的中空管狀纖維組成，管狀纖維的側面分布有大量nm級的孔洞。脈管鋪設在凹槽腔中后，細胞營養液先經過進流腔流入脈管的中空管內，再從側面孔洞中滲漏出來才接觸到細胞，從而真實模擬體內毛細血管供血的生理狀況，使體外再生組織成為可能。

即使按照以上工藝步驟，引入了灌流式營養液運輸及在細胞器中填充脈管降低死角體積，如果所選用的脈管材料不合適，仍不能使干細胞分化成組織。脈管是一種具有網孔結構的高分子合成材料，它應該具備充分的可變形性，足夠的親水性表面以及最佳的生物適配性。在尋找適于作為脈管的材料方面，不能考慮剛性物質。通過對膠原纖維和羊毛等大量海綿類物質進行實驗篩選，我們最終發現，聚酯纖維是適合制造脈管的最佳材料。

干細胞是具有多向分化潛能的原始細胞，是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的原始細胞。在加入特定誘導因子的條件下，它可以分化成多種功能細胞或組織器官，醫學界稱其為“萬用細胞”。目前，干細胞治療方興未艾，即把健康的干細胞移植到病人體內，以達到修復病變細胞或重建功能正常的組織的目的。近年來，成人干細胞移植在挽救白血病、淋巴癌和其它血液病人生命方面發揮了重要作用。但是，直接將干細胞植入人體內，存在著發展成腫瘤的風險。毫無疑問，將干細胞在體外預先定向分化成所需的組織，再移植到體內，代表了未來臨床治療的方向。

透析和器官移植是目前臨床上處理腎衰竭的二種常用治療方案。然而，高昂的醫療費用，短暫的透析壽命（一般僅能維持幾年）和匱乏的供體器官是造成急慢性腎衰竭死亡率高的成因。運用本發明三維灌流式細胞培養器，我們在世界上首次使新生腎皮質部位的胚胎干細胞/祖先細胞成功分化為腎小管，為治療腎小管壞死造成的急慢性腎炎帶來新的希望。

發明內容