[發明專利]一種來源于豬睪丸類胚胎干細胞的分離方法

無效

• 申請號: 201410024688.7
• 申請日: 2014-01-20
• 公開（公告）號: CN103805557A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 趙會敏;盧克煥;盧盛晟;陸陽清;楊小淦;楊歡;李敏霞;張颯
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 彭曉玲

技術領域

本發明涉及一種來源于豬睪丸類胚胎干細胞的分離方法，屬于干細胞生物工程。

背景技術

睪丸干細胞又可稱為來源于睪丸組織的類胚胎干細胞或多功能干細胞。2004年，Mito?Kanatsu-Shinohara等從新生小鼠睪丸消化成分散的細胞，然后在明膠包被的培養皿中培養，第二天將沒有貼壁的細胞收集后，接種到小鼠成纖維細胞飼養層上，基礎培養液為DMEM，添加15%FCS（胎牛血清）、2-巰基乙醇、bFGF（堿性成纖維細胞生長因子），經過多代培養，形成了多功能干細胞克隆。2009年，Nady?Golestaneh將人睪丸內的生殖細胞分離出來，在明膠包被的培養皿中培養，其培養基為DMEM，添加15%血清替代品、L-谷氨酰胺、非必須氨基酸、β-巰基乙醇、bFGF，培養后得到了類胚胎干細胞。2010年，S.C.Mizrak將人的睪丸組織消化成分散的細胞，在StemPro培養液中培養，得到了類胚胎干細胞。2012年，J.V.Chikhovskaya將人的睪丸細胞消化成分散的細胞，接種到小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上，添加人胚胎干細胞培養基(KO-DMEM)，添加15%FCS、bFGF等，得到類胚胎干細胞。現有的技術方案的應用對象是人或小鼠，對豬的研究很少。

發明內容

本發明的目的在于提供一種來源于豬睪丸類胚胎干細胞的分離方法。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

一種來源于豬睪丸類胚胎干細胞的分離方法，包括配制培養液、配制消化酶、豬睪丸類胚胎干細胞的分離三個步驟，其中：所述配制的培養液由α-MEM、血清替代品、青霉素、鏈霉素組成。

優選的是：培養液中血清替代品加入量為10%α-MEM體積，每毫升α-MEM加入100U青霉素、100μg鏈霉素。

優選的是：豬睪丸類胚胎干細胞在此培養液的培養條件：32.5-37℃，通入含有5%體積分數CO₂的空氣條件下培養10-15天，3天換一次等量的培養液。

所述的配制消化酶包括消化酶I、消化酶II、消化酶III配制，具體方法為，

消化酶I：膠原酶按2mg/ml、DNaseI按50μg/ml溶于DMEM/F12中；

消化酶II：膠原酶按2mg/ml、透明質酸酶按2mg/ml、DNaseI按50μg/ml溶于DMEM/F12中；

消化酶III：胰酶按0.25mg/ml、DNaseI按50μg/ml溶于DMEM/F12中。

所述的豬睪丸類胚胎干細胞的分離具體方法為：

1、從農場選1月齡一下的豬，取出睪丸，放入PBS中，帶回實驗室。

2、將睪丸放入體積分數為75%酒精中浸泡10min。

3、去掉睪丸白膜，繼續在體積分數為75%酒精中浸泡10min。

4、切開睪丸，取睪丸組織2g，剪碎。

5、消化，加8-10ml消化酶I，37℃水浴、90轉/min搖床消化40-60min，380g條件下離心5min；

6、棄消化酶I；加8-10ml消化酶II，37℃水浴、90轉/min搖床消化20-30min，380g條件下離心5min；

7、棄消化酶II；加8-10ml消化酶III，37℃水浴、90轉/min搖床消化10-15min。

8、加1ml血清終止消化。

9、用孔徑為40μm的細胞過濾篩過濾。

10、用36ml培養液稀釋細胞，然后將細胞接種到12孔培養板中，每孔細胞為3×10⁵個細胞，加入1ml培養液。

11、在32.5-37℃，通入含有5%體積分數CO₂的空氣條件下培養10-15天，3天換一次等量的培養液。

本發明使用的培養液成分簡單，克隆形成效果好，解決了豬睪丸類胚胎干細胞的分離的問題。

附圖說明

圖1為培養10天睪丸類胚胎干細胞克隆的形態，圖2為培養15天睪丸類胚胎干細胞克隆的形態。

具體實施方式

下面結合具體實施例，對本發明作進一步詳細的闡述，但本發明的實施方式并不局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發明，而非用于限制本發明的范圍。此外，在閱讀本發明的內容后，本領域的技術人員可以對本發明作各種修改，這些等價變化同樣落于本發明所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1

（一）溶液的配制