[發(fā)明專利]紅串紅球菌XS1012及在制備手性醇中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410024110.1
• 申請(qǐng)日: 2014-01-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103773724A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王普;李軍;黃金
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P7/22;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.紅串紅球菌(Rhodococcus?erythropolis)XS1012，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年12月11日，保藏地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC?NO：M2013650。

2.如權(quán)利要求1所述紅串紅球菌XS1012在制備(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮為底物，以紅串紅球菌XS1012經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，于pH為6.0～8.5的緩沖液或蒸餾水構(gòu)成的反應(yīng)體系中，在20℃～35℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，取上清液加入等體積的正己烷萃取，萃取液即為含有目標(biāo)產(chǎn)物的混合液，混合液經(jīng)分離純化得到(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。

3.如權(quán)利要求2所述紅串紅球菌XS1012在制備(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)體系中，底物的初始終濃度為10～200mmol/L，濕菌體的用量以菌體干重計(jì)為15～70g/L。

4.如權(quán)利要求2所述紅串紅球菌XS1012在制備(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)體系中還添加有輔助底物構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，所述輔助底物為下列一種或兩種及以上任意比例的混合：①甲醇、②乙醇、③異丙醇、④甘油、⑤葡萄糖、⑥果糖、⑦蔗糖或⑧麥芽糖。

5.如權(quán)利要求4所述紅串紅球菌XS1012在制備(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用，其特征在于所述輔助底物為下列之一：①葡萄糖、②異丙醇或③葡萄糖與異丙醇的混合。

6.如權(quán)利要求4所述紅串紅球菌XS1012在制備(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用，其特征在于所述輔助底物為葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖時(shí)，加入終濃度為20～200g/L轉(zhuǎn)化體系，輔助底物為甲醇、乙醇、異丙醇或甘油時(shí)，加入體積終濃度為10～30%。

7.如權(quán)利要求6所述紅串紅球菌XS1012在制備(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用，其特征在于所述輔助底物為葡萄糖和異丙醇，轉(zhuǎn)化體系中葡萄糖加入終濃度為20～100g/L，異丙醇的體積終濃度為10～20%。

8.如權(quán)利要求2所述紅串紅球菌XS1012在制備(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用按如下步驟進(jìn)行：

以[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮為底物，以紅串紅球菌XS1012經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，加入輔助底物，于pH為6.0～8.5的磷酸緩沖液或蒸餾水構(gòu)成的轉(zhuǎn)化體系中，在25℃～35℃條件下反應(yīng)24～48h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，取上清液加入等體積的正己烷萃取，萃取液即為含有目標(biāo)產(chǎn)物的混合液，混合液經(jīng)分離純化得到(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇；所述轉(zhuǎn)化體系中，底物的初始終濃度為10～200mmol/L，濕菌體的用量以菌體干重計(jì)為20～60g/L；所述輔助底物為葡萄糖和異丙醇，轉(zhuǎn)化體系中葡萄糖的添加終濃度為20～100g/L，異丙醇的添加體積終濃度為10～20%。

9.如權(quán)利要求2或8所述紅串紅球菌XS1012在制備(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用，其特征在于所述混合液分離純化的方法為：混合液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾濃縮5倍體積，然后加入柱體積1～5%的硅膠混勻后，轉(zhuǎn)移至含有硅膠的層析柱中，再添加柱體積1～5%的硅膠，然后以體積比為8：1的石油醚和乙酸乙酯混合液為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析分離，收集合并含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，將含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干，即得(S)-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇。

10.如權(quán)利要求2或4所述紅串紅球菌XS1012在制備(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用，其特征在于所述酶源按如下方法獲得：

1）斜面培養(yǎng)：挑取紅串紅球菌XS1012單菌落接種至斜面培養(yǎng)基，25～32℃培養(yǎng)2～3d，4℃冰箱保存；斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖10～25g/L，蛋白胨5～20g/L，酵母膏3～15g/L，(NH₄)₂SO₄1.5～6.0g/L，KH₂PO₄1.0～4.5g/L，NaCl0.5～2.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5～6.0g/L，瓊脂15～20g/L，溶劑為水，pH6.0～7.5；

2）種子培養(yǎng)：從培養(yǎng)成熟的斜面挑一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基中，25～32℃，150～250r/min培養(yǎng)24～48h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖10～25g/L，酵母膏3～15g/L，KH₂PO₄1.0～4.5g/L，(NH₄)₂SO₄1.5～6.0g/L，蛋白胨5～20g/L，NaCl0.5～2.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5～6.0g/L，溶劑為水，pH6.0～7.5；

3）發(fā)酵培養(yǎng)：以體積濃度6～10%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25～32℃，150～250rpm培養(yǎng)24～48h，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，沉淀用磷酸緩沖液洗滌，獲得濕菌體，即為酶源；發(fā)酵培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基。