[發(fā)明專利]殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410023686.6
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103739683A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設計）人: 韓超;龐潔;丁德榮;李勝兵
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心
• 主分類號: C07K14/325
• 分類號: C07K14/325;C12N15/32;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/13;C12N1/19;C12N1/21;C12N7/01;C12P21/02;A01K67/033;A01H5/00;A01N47/44;A01P7/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途，特別是涉及一種改造的PIC10-01殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途。

背景技術

植物蟲害是導致農作物損失的主要因素，給農民造成重大的經(jīng)濟損失，甚至影響到當?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治植物蟲害，人們通常使用廣譜化學殺蟲劑和生物殺蟲制劑，但二者在實際應用中都具有局限性：化學殺蟲劑會帶來環(huán)境污染的問題，并導致抗藥性昆蟲的出現(xiàn)；而生物殺蟲制劑在環(huán)境中容易降解，在生產(chǎn)上需要重復施用，大大增加了生產(chǎn)成本。

為了解決化學殺蟲劑和生物殺蟲制劑在實際應用中的局限性，科學家們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗蟲轉基因植物以防治植物蟲害。PIC10殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是不溶性伴孢結晶蛋白。

PIC10蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性pH環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細胞膜內外的滲透壓變化及pH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。

水稻是中國主要的糧食作物，每年因植物蟲害造成的糧食損失巨大，例如二化螟、三化螟或大螟等。目前未發(fā)現(xiàn)PIC10殺蟲蛋白在植物中的表達水平和毒力的報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途，所述PIC10-01殺蟲蛋白在植物中（尤其為水稻）具有較高的表達量和毒力。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲蛋白質，包括：

（a）如SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或

（b）在（a）中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由（a）衍生的蛋白質。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲基因，包括：

（a）編碼所述殺蟲蛋白質的核苷酸序列；或

（b）在嚴格條件下與（a）限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質的核苷酸序列；或

（c）具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。

所述嚴格條件可為在6×SSC（檸檬酸鈉）、0.5%SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調控序列調控下的所述殺蟲基因。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述表達盒的重組載體。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生殺蟲蛋白質的方法，包括：

獲得包含所述殺蟲基因或所述表達盒的轉基因宿主生物的細胞；

在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質的條件下培養(yǎng)所述轉基因宿主生物的細胞；

回收所述殺蟲蛋白質。

進一步地，所述轉基因宿主生物的細胞包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。

優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，包括：將所述殺蟲蛋白質或所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質在植物中與至少一種不同于所述殺蟲蛋白質或所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質的第二種殺蟲核苷酸一起表達。

進一步地，所述第二種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。

可選擇地，所述第二種殺蟲核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。

在本發(fā)明中，PIC10-01殺蟲蛋白在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現(xiàn)。另外，一種植物（第1親本）可以通過遺傳工程操作表達PIC10-01殺蟲蛋白質，第二種植物（第2親本）可以通過遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質。通過第1親本和第2親本雜交獲得表達引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。