[發(fā)明專利]一種表達(dá)耐酸高溫α-淀粉酶基因突變體的工程菌株

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410023471.4
• 申請(qǐng)日: 2014-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103834606A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟青青;王鳳寰;楊建國(guó);汪兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京中科星冠生物技術(shù)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/56;C12N9/28;C12R1/10
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種表達(dá)耐酸性高溫α-淀粉酶基因的工程菌株。具體說(shuō)是通過(guò)化學(xué)誘變劑對(duì)高溫α-淀粉酶基因amy進(jìn)行突變，再通過(guò)酸性條件篩選獲得新型耐酸高溫α-淀粉酶基因突變體amyM，在地衣芽孢桿菌工程菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)和應(yīng)用。

背景技術(shù)

高溫α-淀粉酶，即能水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的a-1，4葡萄糖苷鍵的α-淀粉酶，因?yàn)槠渥钸m反應(yīng)溫度較高，一般為60攝氏度以上，因此稱為高溫α-淀粉酶。

高溫α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于酒類、味精及淀粉糖等工業(yè)生產(chǎn)，代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝既省工省廠房設(shè)備，又能提高出品率，降低成本，增加效益。地衣桿菌α-淀粉酶是我國(guó)產(chǎn)量最大用途最廣的一種高效液化型淀粉酶，它是由耐熱性能高的地衣桿菌誘變后逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)再經(jīng)提純而獲得的一種酶制劑，主要作用是能將原料中的淀粉質(zhì)液化為糊精。

目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中常用的淀粉酶的最適pH值在6.0～10.0，在酸性條件下，其酶活性降低很明顯，甚至失去活性。隨著我國(guó)淀粉質(zhì)原料深加工工業(yè)的發(fā)展，工藝條件的不斷改變，一些淀粉原料深加工工藝需要在較低的pH值條件下進(jìn)行。所以，開(kāi)發(fā)新型耐酸性α-淀粉酶迫在眉睫。

由于從自然界篩選得到的野生菌株產(chǎn)酸性α-淀粉酶的活力一般都比較低，不能直接運(yùn)用于工業(yè)化的發(fā)酵生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者一般通過(guò)對(duì)野生菌株的誘變、雜交育種等技術(shù)手段，來(lái)提高菌株的產(chǎn)酶能力，戚薇等通過(guò)利用低能N⁺注入枯草芽孢桿菌，誘變后得到的菌株，其酸性α-淀粉酶的酶活為343U／ml，通過(guò)誘變后，與出發(fā)菌株相比較，最適作用pH值偏低一個(gè)單位(戚薇，王海燕，王建玲，等.氮離子注入選育耐酸性α2淀粉酶產(chǎn)生菌誘變效應(yīng)的研究。天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，22(9)：7-8.)。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，基因工程育種技術(shù)由于可以對(duì)基因進(jìn)行預(yù)先設(shè)計(jì)和控制，并且表達(dá)作用效果明顯，所以越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的青睞。蔡恒等把α-淀粉酶的基因改造后，克隆到穿梭質(zhì)粒pBE2中，構(gòu)建了含突變?chǔ)?淀粉酶基因的分泌型誘導(dǎo)表達(dá)載體pBSAT,含有pBSAT的菌株可將突變?chǔ)?淀粉酶分泌到胞外，分泌的α-淀粉酶具有較高的耐酸性(蔡恒，陳忠軍，李金霞，等。α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)。食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(10)：33-36.)；歐洲研究者采用基因改造Bacillus?licheniformis來(lái)生產(chǎn)耐熱性的酸性α-淀粉酶，在原有天然菌株的DNA序列中將N188位的天冬氨酸用其他任何一種氨基酸代替，使在N15或N197位的蛋氨酸殘基缺失，得到的高產(chǎn)菌株所生產(chǎn)的α-淀粉酶適用的液化pH值可以降低到5.0，且在100～110℃時(shí)活性不變(SHAW?A,BOTT?R,DAY?A?G.Protein?engineering?ofα-amylase?for?low?pH?performance.Curr?Opin?Biotechnol，1999(10)：349-352.)。

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，淀粉資源非常豐富，酸性淀粉酶的應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣泛。早在20世紀(jì)70年代，國(guó)內(nèi)就有學(xué)者對(duì)酸性淀粉酶開(kāi)始了研究，取得了一些研究成果，但與國(guó)外相比，差距甚遠(yuǎn)，我國(guó)產(chǎn)酸性α-淀粉酶的菌株較單一，且酶活較低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)耐酸性高溫α-淀粉酶的基因工程菌株。

本發(fā)明所提供的可表達(dá)高溫α-淀粉酶的工程菌，是將來(lái)自于地衣芽孢桿菌(Bacillus?Licheniformis)高溫α-淀粉酶基因進(jìn)行突變，得到突變體，然后把表達(dá)耐酸性高溫α-淀粉酶基因突變體重組載體導(dǎo)入地衣芽孢桿菌中，篩選得到的高溫α-淀粉酶耐酸性提高的工程菌株；所述高溫α-淀粉酶氨基酸序列如序列表1所示；所述耐酸性高溫α-淀粉酶突變體氨基酸序列如序列表2所示。

所述地衣芽孢桿菌（Bacillus?Licheniformis)為地衣芽孢桿菌（Bacillus?Licheniformis)CICC10181。所述可表達(dá)耐酸性高溫α-淀粉酶的工程菌優(yōu)選為地衣芽孢桿菌(Bacillus?Licheniformi5)ZHWY?CGMCC?No.6669。

所述地衣芽孢桿菌(Bacillus?Licheniformis)ZHWY?CGMCC?No.6669，已于2012年10月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC?No.6669。