[發明專利]一種表達耐酸高溫α-淀粉酶基因突變體的工程菌株

無效

• 申請號: 201410023471.4
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN103834606A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 孟青青;王鳳寰;楊建國;汪兵
• 申請（專利權）人: 北京中科星冠生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;C12N9/28;C12R1/10
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技術領域

本發明涉及一種表達耐酸性高溫α-淀粉酶基因的工程菌株。具體說是通過化學誘變劑對高溫α-淀粉酶基因amy進行突變，再通過酸性條件篩選獲得新型耐酸高溫α-淀粉酶基因突變體amyM，在地衣芽孢桿菌工程菌中實現表達和應用。

背景技術

高溫α-淀粉酶，即能水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的a-1，4葡萄糖苷鍵的α-淀粉酶，因為其最適反應溫度較高，一般為60攝氏度以上，因此稱為高溫α-淀粉酶。

高溫α-淀粉酶廣泛應用于酒類、味精及淀粉糖等工業生產，代替傳統工藝既省工省廠房設備，又能提高出品率，降低成本，增加效益。地衣桿菌α-淀粉酶是我國產量最大用途最廣的一種高效液化型淀粉酶，它是由耐熱性能高的地衣桿菌誘變后逐級擴大培養再經提純而獲得的一種酶制劑，主要作用是能將原料中的淀粉質液化為糊精。

目前，國內外市場中常用的淀粉酶的最適pH值在6.0～10.0，在酸性條件下，其酶活性降低很明顯，甚至失去活性。隨著我國淀粉質原料深加工工業的發展，工藝條件的不斷改變，一些淀粉原料深加工工藝需要在較低的pH值條件下進行。所以，開發新型耐酸性α-淀粉酶迫在眉睫。

由于從自然界篩選得到的野生菌株產酸性α-淀粉酶的活力一般都比較低，不能直接運用于工業化的發酵生產。國內外學者一般通過對野生菌株的誘變、雜交育種等技術手段，來提高菌株的產酶能力，戚薇等通過利用低能N⁺注入枯草芽孢桿菌，誘變后得到的菌株，其酸性α-淀粉酶的酶活為343U／ml，通過誘變后，與出發菌株相比較，最適作用pH值偏低一個單位(戚薇，王海燕，王建玲，等.氮離子注入選育耐酸性α2淀粉酶產生菌誘變效應的研究。天津科技大學學報，2007，22(9)：7-8.)。隨著分子生物學的迅速發展，基因工程育種技術由于可以對基因進行預先設計和控制，并且表達作用效果明顯，所以越來越受到國內外研究者的青睞。蔡恒等把α-淀粉酶的基因改造后，克隆到穿梭質粒pBE2中，構建了含突變α-淀粉酶基因的分泌型誘導表達載體pBSAT,含有pBSAT的菌株可將突變α-淀粉酶分泌到胞外，分泌的α-淀粉酶具有較高的耐酸性(蔡恒，陳忠軍，李金霞，等。α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢桿菌中的分泌表達。食品與發酵工業，2005，31(10)：33-36.)；歐洲研究者采用基因改造Bacillus?licheniformis來生產耐熱性的酸性α-淀粉酶，在原有天然菌株的DNA序列中將N188位的天冬氨酸用其他任何一種氨基酸代替，使在N15或N197位的蛋氨酸殘基缺失，得到的高產菌株所生產的α-淀粉酶適用的液化pH值可以降低到5.0，且在100～110℃時活性不變(SHAW?A,BOTT?R,DAY?A?G.Protein?engineering?ofα-amylase?for?low?pH?performance.Curr?Opin?Biotechnol，1999(10)：349-352.)。

我國是農業大國，淀粉資源非常豐富，酸性淀粉酶的應用范圍也越來越廣泛。早在20世紀70年代，國內就有學者對酸性淀粉酶開始了研究，取得了一些研究成果，但與國外相比，差距甚遠，我國產酸性α-淀粉酶的菌株較單一，且酶活較低。

發明內容

本發明的目的是提供一種表達耐酸性高溫α-淀粉酶的基因工程菌株。

本發明所提供的可表達高溫α-淀粉酶的工程菌，是將來自于地衣芽孢桿菌(Bacillus?Licheniformis)高溫α-淀粉酶基因進行突變，得到突變體，然后把表達耐酸性高溫α-淀粉酶基因突變體重組載體導入地衣芽孢桿菌中，篩選得到的高溫α-淀粉酶耐酸性提高的工程菌株；所述高溫α-淀粉酶氨基酸序列如序列表1所示；所述耐酸性高溫α-淀粉酶突變體氨基酸序列如序列表2所示。

所述地衣芽孢桿菌（Bacillus?Licheniformis)為地衣芽孢桿菌（Bacillus?Licheniformis)CICC10181。所述可表達耐酸性高溫α-淀粉酶的工程菌優選為地衣芽孢桿菌(Bacillus?Licheniformi5)ZHWY?CGMCC?No.6669。

所述地衣芽孢桿菌(Bacillus?Licheniformis)ZHWY?CGMCC?No.6669，已于2012年10月12日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC?No.6669。