[發(fā)明專利]一種新型錯(cuò)配結(jié)合蛋白與纖維素結(jié)合域3的融合蛋白及其高通量去除DNA合成中錯(cuò)誤的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410023235.2
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103755815A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪泂;高曉連;宛雯;周小川
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/10;B01J20/26;B01D15/08
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及構(gòu)建一種能夠去除寡核苷酸及DNA中合成錯(cuò)誤的融合蛋白MutS及其應(yīng)用的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及利用固定化重組錯(cuò)配結(jié)合蛋白MutS固定化構(gòu)建纖維素柱的方法。本發(fā)明還涉及MutS纖維素的層析柱對芯片合成寡核苷酸及其組裝DNA的合成錯(cuò)誤的糾正的方法，特別是利用這種固定重組蛋白的層析柱高效快速的高通量糾正DNA的合成錯(cuò)誤的方法。?

背景技術(shù)

基因的從頭合成技術(shù)無論在合成生物學(xué)，系統(tǒng)生物學(xué)以及普遍的生命科學(xué)研究中發(fā)揮著越來越重要的作用[1-6]?；虻膹念^合成普遍采用的策略是使用合成的寡核苷酸作為原材料，再利用各種拼接方法將這些短的寡核苷酸組裝成較長的目的基因。然而，這些寡核苷酸合成價(jià)格以及合成通量成為了基因從頭合成面臨的問題?，F(xiàn)在，采用傳統(tǒng)的DNA合成技術(shù)所提供的寡核苷酸(100～200堿基)普遍的價(jià)格是0.4～1.0美元/堿基。然而，與傳統(tǒng)的DNA合成技術(shù)相比較利用微列陣及微流體技術(shù)合成的寡核苷酸則需要較低的價(jià)格，并且達(dá)到更高的通量[7-12]。例如，采用微流體的DNA合成技術(shù)可以在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的芯片上同時(shí)并行合成百萬條不同的寡核苷酸[13,14]。在某些寡核苷酸合成事例中，基于微列陣的DNA芯片合成技術(shù)可以提供一百萬種60個(gè)堿基長度的寡核苷酸庫而只需要約600美元的價(jià)格[14,15]。?

然而，利用芯片合成的寡核苷酸進(jìn)行基因的從頭合成中還存在多個(gè)技術(shù)瓶頸。1)與傳統(tǒng)技術(shù)合成的寡核苷酸相比，芯片合成的每種寡核苷酸的平均數(shù)量很低。在一個(gè)芯片上，可以一次性合成成千上萬種寡核苷酸，但是每種寡核苷酸的數(shù)量只有10⁴～10⁶條[12]。2)芯片合成的寡核苷酸庫的成?分很復(fù)雜。合成的寡核苷酸從芯片上切割下來后會形成一個(gè)含有成千上萬不同種類寡核苷酸的文庫，而當(dāng)使用這些寡核苷酸進(jìn)行后續(xù)的基因全長的組裝時(shí)，由于文庫中的序列的多樣性將給全長基因的組裝帶來很大的困難。3)芯片合成的寡核苷酸的質(zhì)量較傳統(tǒng)方法合成的寡核苷酸差。當(dāng)這些寡核苷酸組裝成為全長基因的時(shí)候(500～5000nt)，由于寡核苷酸本身的合成錯(cuò)誤而給組裝的全長基因引入大量的突變。幸運(yùn)的是，芯片合成寡核苷酸較低的產(chǎn)量和復(fù)雜的組成可以通過引入通用引物以及高保真PCR技術(shù)得到部分的解決。通過向寡核苷酸序列兩端加入不同的通用引物，可以將復(fù)雜的文庫分割為多個(gè)成分較為簡單的亞文庫，然后通過高保真PCR擴(kuò)增這些目的寡核苷酸亞庫從而得到較高量的成分較為簡單的亞文庫[12]。綜上所述，芯片合成寡核苷酸的質(zhì)量變成了利用芯片合成DNA進(jìn)行基因從頭合成的最主要的障礙。?

提高芯片合成寡核苷酸的質(zhì)量可以通過提高合成過程中合成循環(huán)的效率[16]或者在芯片合成后的進(jìn)行DNA糾錯(cuò)[8,12,17]。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的，通過優(yōu)化試劑流動以減少寡核苷酸合成過程中的脫嘌呤化(depurination)作用，從而有效的降低合成中的副反應(yīng)(side?reactions)，最終提高目標(biāo)寡核苷酸的合成質(zhì)量以及產(chǎn)量[16]。高效液相色譜(HPLC)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)也可以用于提高合成寡核苷酸的質(zhì)量[15,18]。使用這些方法，約90%的會導(dǎo)致合成寡核苷酸長度變化的合成錯(cuò)誤可以被去除。除此以外，一種設(shè)計(jì)合成兩張含有互補(bǔ)序列的芯片，然后通過雜交選擇的方法可以將芯片合成寡核苷酸的正確率提高約9倍[12].另外還有文獻(xiàn)報(bào)道了，一種高并行高通量的寡核苷酸糾錯(cuò)方法，該方法結(jié)合高通量的DNA測序技術(shù)，設(shè)計(jì)使用一種高通量的平臺特異性的選擇那些測序顯示序列正確的寡核苷酸，從而提高芯片合成寡核苷酸的質(zhì)量。通過該方法可以獲得正確率提高了約500倍的寡核苷酸[19]。?