[發(fā)明專利]一種高立體選擇性酯水解酶、編碼基因及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410022841.2
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103820416B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪釗;鄭建永;應(yīng)向賢;章銀軍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,冷紅梅

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高立體選擇性酯水解酶及其編碼基因，以及含有該編碼基因的載體、工程菌及其應(yīng)用。

（二）背景技術(shù)

酯水解酶包括有脂肪酶和酯酶，它是一類在手性合成中有著重要用途的生物催化劑。這些酶能識別很寬的底物，目前＞40%的生物不對物合成反應(yīng)可有酯水解酶催化完成，這些反應(yīng)具有條件溫和、反映的區(qū)域選擇性和立體選擇性高等特點。在酶動力學(xué)拆分外消旋酯、胺和轉(zhuǎn)化前手性醇等方面等到廣泛的應(yīng)用。另外，它們還可用于選擇性酯化、轉(zhuǎn)酯化和聚合反應(yīng)中。

由于對手性藥物和中間體需求的增長，利用生物法或酶法合成手性化合物日益得到人們的重視和工業(yè)化應(yīng)用。生物法合成手性化合物的關(guān)鍵問題在于尋找具有高度立體選擇性催化功能的生物催化劑。由于酯水解酶具有廣泛的用途，篩選新的酯水解酶正成為酶工程的研究熱點。雖然酯水解酶在微生物界分布很廣，但它們的立體選擇性催化功能不一樣。在同一生物體內(nèi)往往存在多種酯水解酶，由于它們之間立體選擇性存在差異性，利用為生物細胞或它們的粗酶制品進行酶法合成手性化合物時往往會降低產(chǎn)物的光學(xué)純度（Geun-Joong?Kim,Journal?of?Molecular?Catalysis?B:Enzymatic17，2002:29-38）。解決這一問題可以通過工程的調(diào)控手段來減少副反應(yīng)的發(fā)生,也可以通過分離純化得到單一的酶制劑來進行催化反應(yīng)，但這些過程往往較復(fù)雜和高的成本，再生產(chǎn)中不易被采用。如果通過基因工程的手段，直接克隆和表達所需要的酶的基因，就能夠很方便達到以上的目的。

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種篩選獲得的具有較高R-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，含有該編碼基因的載體、工程菌及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種具有R-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明人通過篩選大量的微生物，發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌能產(chǎn)生一種具有高度R-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，本發(fā)明酯水解酶來自蠟狀芽孢桿菌（Bacillus?cereus）WZZ001，保藏編號CCTCC?M2012403，已在CN102994429A中披露。發(fā)明人通過PCR擴增得到芽孢桿菌WZZ001的一種具有R-異構(gòu)體立體選擇性的酯酶基因BCEST，測定了其核苷酸序列，如序列表中SEQ?ID?No.1所示，其中編碼序列（CDS）從DNA第1個堿基起至第1458終止，ATG為轉(zhuǎn)錄起始密碼子，TAA為轉(zhuǎn)錄終止密碼；并得到相應(yīng)的氨基酸序列，如列表中SEQ?ID?No.2所示。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。

本發(fā)明還涉及所述酯水解酶的編碼基因。具體的，所述基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ?ID?NO.1所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的肽蛋白的功能。

本發(fā)明還涉及含有所述編碼基因的重組載體，以及利用所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。