[發明專利]一種玉米黃質合成基因重組質粒及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201410022263.2
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103740744A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 張利平;孔敏;湯暉
• 申請（專利權）人: 河北大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;G01N30/02
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 白海靜

技術領域

本發明涉及重組質粒及其制備方法和用途，具體的說是一種玉米黃質合成基因重組質粒及其制備方法和用途。

背景技術

玉米黃質,亦稱玉米黃素(Zeaxanthin,3,3-二羥基-β-胡蘿卜素),脂溶性化合物,屬葉黃素類類胡蘿卜素。近年來的藥理學和生理學研究發現玉米黃質具有極強抗氧化性，其在預防眼睛黃斑退化所致失明與老年性白內障、預防部分腫瘤的發生和發展、減少某些心血管病的危險發生方面具有顯著作用。作為三大主要糧食作物之一的玉米,其籽粒中玉米黃質含量豐富,通過基因工程育種,培育富含玉米黃質的鮮食玉米,可以進一步發揮其保健應用價值,具有較大的發展前景。目前,玉米規模化轉基因主要以愈傷組織為受體,其誘導和培養受玉米基因型和取材季節的限制很大,且培養、轉化、篩選和再生的周期較長,轉基因操作的規模一般較小,難以保證轉化成功。以莖尖生長點為受體的農桿菌介導的原位轉化法,不依賴于組織培養,受基因型限制小,操作簡單,實驗周期短,可以從絕大多數材料中獲得轉基因植株。但是,轉化效率還有待提高,而且所獲轉化體大多為嵌合體,后代分離鑒定較為困難,所以還需要進一步研究改進。近來通過構建玉米黃質生物代謝工程合成玉米黃質逐漸受到研究人員的青睞，但由于玉米黃質在微生物體內的合成步驟多且復雜，因此研制能夠高效表達玉米黃質多種合成酶的載體成為人們研究的熱點和難點。另外，研究人員對研發過程中目標受體玉米黃質合成代謝途徑中主要酶系的功能的檢測也存在很多困惑，如通過離體的生化反應或利用基因突變株進行功能互補的方法進行檢測，其操作步驟比較繁瑣，并且效率也不高。因此如何獲得一種高效檢測目標受體玉米黃質合成基因活性的方法亦是本領域研究人員所關注的問題。

發明內容

本發明的目的之一就是提供一種高效表達玉米黃質多種合成基因的重組質粒，以期能夠準確、快速構建出玉米黃質生產菌株；本發明的目的之二就是提供該重組質粒的一種制備方法；本發明的目的之三就是提供一種該重組質粒的用途，即所述重組質粒在檢測玉米黃質合成主要相關基因的功能中的應用，更具體地說是所述重組質粒pET-Zea在檢測目標受體玉米黃質合成基因活性中的應用。

本發明的目的是按如下的技術方案實現的：

本發明所提供的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea，其攜帶有crtE基因、crtB基因、crtI基因、crtY基因、crtZ基因，該重組質粒的結構如圖1所示；

所述重組表達質粒是在表達載體pET-28a上依次連接有crtE基因、crtB基因、crtI基因、crtY基因、crtZ基因，其中表達載體pET-28a與crtE基因之間具有NdeⅠ酶切位點，crtE基因與crtB基因之間具有HpaⅠ酶切位點，crtB基因與crtI基因之間具有MfeⅠ酶切位點，crtI基因與crtY基因之間具有NheⅠ酶切位點，crtY基因與crtZ基因之間具有AhaⅢ酶切位點，crtZ基因與表達載體pET-28a之間具有NotⅠ酶切位點。

所述的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea，其堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示。

其中所述crtE基因、crtY基因、crtI基因、crtB基因、crtZ基因分別是成團泛菌Pantoea?agglomerans的GGPP合成酶基因、番茄紅素環化酶基因、八氫番茄紅素脫氫酶基因、八氫番茄紅素合成酶基因和胡蘿卜素羥化酶基因。

本發明所提供的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea，在導入大腸桿菌BL21菌株后，成功地實現了玉米黃質在大腸桿菌細胞體內的積累，由此可準確、快速構建玉米黃質生產菌株。

本發明所提供的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea的制備方法，包括如下步驟：

Ⅰ）基因擴增：

提取Pantoea?agglomerans?ACCC10495的基因組DNA，采用PCR擴增crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ基因編碼區，相應引物分別為P1/P2、P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10：

所述P1的堿基序列為5’-CAGCATATGATGGTGAGTGGCAGT-3’

所述P2的堿基序列為5’-TTAATTGTTAACTCAGGCGATTTTCAT-3’

所述P3的堿基序列為5’-TTAATTGTTAACATGAGCCAACCGCCG-3’

所述P4的堿基序列為5’-GGGCCCCAATTGCTAAACGGGACGCTG-3’