[發明專利]一種農桿菌介導的培育轉基因大巖桐的方法

無效

• 申請號: 201410022247.3
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103734015A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 王曉云;李達;戰春燕;徐佳寧
• 申請（專利權）人: 濟南市農業科學研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N15/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種大巖桐快速繁殖方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)外植體誘導愈傷組織及誘導出芽：

取大巖桐組培苗的葉片和葉柄，將葉片切成0.5～1cm²的方塊，葉柄切成0.5～1cm片段，放到誘導培養基上培養，配方為：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L?NAA+15g/L蔗糖；

(2)芽誘導生芽：

待小芽長到2～3cm時，將其從愈傷組織上切下，切掉莖尖，放入培養基MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L?NAA+30g/L蔗糖中繼代增殖；

(3)新生芽生根成完整植株：

將增殖大量得到的小芽移至含MS+0.2mg/L?NAA+30g/L蔗糖的生根培養基中培養，生根，成長成完整植株后馴化移栽。

2.根據權利要求1所述的大巖桐快速繁殖方法，其特征在于：所述馴化移栽的具體操作為：移栽前首先將讓小苗接觸瓶外空氣，馴化2d；然后將生根小苗從培養基中取出，用水洗凈，將生根小苗在多菌靈中浸泡8～10s，然后將小苗栽入盛有栽培基質的花盆中，放入溫室中培養。

3.一種農桿菌介導的培育轉基因大巖桐的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)構建植物表達載體：

擴增目的基因，連接質粒表達載體，轉化農桿菌，得含目的基因的農桿菌；

(2)農桿菌侵染大巖桐：

取大巖桐組培苗葉片切成0.5～1cm²的方塊，葉柄切成0.5～1cm片段，均放到誘導培養基MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L?NAA+15g/L蔗糖上培養，預培養1～2d，備用；

(3)將步驟(1)制備的含目的基因的農桿菌接種到YEP液體培養基中，培養基中添加50μg·mL^-1卡那霉素，搖瓶培養至OD₆₀₀＝0.5～0.6，離心獲得菌體沉淀；然后用液體MS培養基重懸菌體沉淀，將上述預培養的外植體浸入該重懸菌液中，浸染3～5min，用無菌濾紙吸去多余菌液，將浸染后的外植體接種到培養基組成為MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L?NAA+15g/L蔗糖的培養基上，25℃暗培養1～2d；

(4)侵染后外植體誘導愈傷組織并生芽：

將步驟(3)共培養后的葉片和葉柄用含250mg/L頭孢曲松鈉的無菌水洗5～7次，無菌濾紙吸干，接種于添加250mg/L?Cef和20mg/L?Kan的MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L?NAA+15g/L蔗糖誘導培養基上培養；

(5)轉基因新塵芽增殖擴繁并塵根：

步驟(4)中獲得的不定芽長至2～3cm時，從愈傷組織上切下，切掉莖尖，放入培養基MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L?NAA中繼代增殖；將增殖得到的叢生芽移至含10mg/L?Kan的MS+0.2mg/L?NAA塵根篩選培養基中，生根成完整植株，然后進行馴化移栽。

4.根據權利要求3所述的農桿菌介導的培育轉基因大巖桐的方法，其特征在于：所用質粒載體為pBI121，農桿菌為LBA4404。

5.根據權利要求3所述的農桿菌介導的培育轉基因大巖桐的方法，其特征在于：所述馴化移栽的具體操作為：移栽前首先將讓小苗接觸瓶外空氣，馴化2d；然后將生根小苗從培養基中取出，用水洗凈，將生根小苗在多菌靈中浸泡8～10s，然后將小苗栽入盛有栽培基質的花盆中，放入溫室中培養。