[發明專利]轉基因作物中cry2Ab基因的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201410022074.5
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103773867A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 李飛武;閆偉;龍麗坤;李蔥蔥;張明;邢珍娟;董立明
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.轉基因作物中cry2Ab基因的LAMP檢測引物組，包括外引物1和外引物2、內引物1和內引物2、環引物1和環引物2，其核苷酸序列分別如下所示：

外引物1：ACTGTTCCTC?AACCGCTTG（SEQ?ID?NO：1）；

外引物2：GGAGTAGTCC?CTGGTGTAGT（SEQ?ID?NO：2）；

內引物1：AGGAGAGGTG?CAGGTTGGCA?CTCAGTTCCA?GATGCAAGGC（SEQ?ID?NO：3）；

內引物2：GACGTGATCC?TCAACGCTGA?CGTCTTCAGG?TAGTCGCGGT?AG（SEQ?ID?NO：4）；

環引物1：CTGAGCAAAG?AGTGGCAGCA（SEQ?ID?NO：5）；

環引物2：GGGCATCTCT?GCAGCCA（SEQ?ID?NO：6）。

2.轉基因作物中cry2Ab基因的LAMP檢測試劑盒，包括以下組分：

（1）引物溶液：由權利要求1所述的6條引物配制的混合溶液，引物的濃度依次為4~6?μmol/L、4~6?μmol/L、32~48?μmol/L、32~48?μmol/L、16~24?μmol/L、16~24?μmol/L；

（2）具有鏈置換活性的DNA聚合酶：濃度為7~9?U/μL；

（3）10×反應緩沖液：200?mmol/L?Tris-HCl?(pH?8.8)，100?mmol/L?KCl，100?mmol/L?(NH₄)₂SO₄，20~80?mmol/L?MgSO₄，6~14?mol/L甜菜堿；

（4）dNTPs溶液：由濃度分別為10?mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；

（5）陽性DNA對照樣品：轉cry2Ab基因作物的基因組DNA，或含有cry2Ab基因的大腸桿菌質粒DNA；

（6）陰性DNA對照樣品：不含cry2Ab基因序列的DNA。

3.根據權利要求2所述的cry2Ab基因的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述的引物溶液中含有5?μmol/L外引物1、5?μmol/L外引物2、40?μmol/L內引物1、40?μmol/L內引物1、20?μmol/L環引物1、20?μmol/L環引物2。

4.根據權利要求2所述的cry2Ab基因的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述的具有鏈置換活性的DNA聚合酶為Bst?DNA聚合酶，濃度為8?U/μL。

5.根據權利要求2所述的cry2Ab基因的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述的10×反應緩沖液中MgSO₄、甜菜堿的濃度分別為40?mmol/L、8?mol/L。

6.利用權利要求2~5任一項所述的試劑盒檢測轉基因組作物中cry2Ab基因的方法，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品的基因組DNA；

（2）配制待測樣品的LAMP檢測反應體系：在200?μL?PCR反應管內加入DNA模板2~5?μL、引物溶液1?μL、Bst?DNA聚合酶1?μL、10×反應緩沖液2.5?μL、dNTPs溶液4?μL，用滅菌去離子水補齊到25?μL；

（3）配制對照樣品的LAMP檢測反應體系：配制陽性對照、陰性對照反應體系時，除將DNA模板分別換成陽性DNA對照樣品、陰性DNA對照樣品外，其他組分與步驟（2）一致；

（4）運行LAMP擴增反應：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min終止反應；

（5）LAMP擴增結果的鑒定：通過肉眼觀察或利用濁度儀觀察反應管內沉淀的濁度變化來判斷擴增結果、或取1~5?μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

7.根據權利要求2~5任一項所述的轉cry2Ab基因作物的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：試劑盒中還包括顯色劑，所述顯色劑為SYBR?GREEN?I熒光染料。

8.利用權利要求7所述的試劑盒檢測轉cry2Ab基因作物的方法，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品的基因組DNA；

（2）配制待測樣品的LAMP檢測反應體系：在200?μL?PCR反應管內加入DNA模板2~5?μL、引物溶液1?μL、Bst?DNA聚合酶1?μL、10×反應緩沖液2.5?μL、dNTPs溶液4?μL，用滅菌去離子水補齊到25?μL；

（3）配制對照樣品的LAMP檢測反應體系：配制陽性對照、陰性對照反應體系時，除將DNA模板分別換成陽性DNA對照樣品、陰性DNA對照樣品外，其他組分與步驟（2）一致；

（4）運行LAMP擴增反應：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min終止反應；

（5）LAMP擴增結果的鑒定：在反應管中加入1~2?μL?顯色劑，通過肉眼觀察顯色結果來判斷擴增結果。