[發(fā)明專利]一種黑莓細胞懸浮培養(yǎng)液的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410021769.1
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103756971A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 方亮;張春紅;李維林;湯飛云;吳文龍;胡淑英
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/02;C12N15/84
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238
• 代理人: 裴詠萍

1.一種黑莓細胞懸浮培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于：該制備方法通過農桿菌介導將γ-TMT基因表達載體轉入黑莓外植體細胞中，經細胞懸浮培養(yǎng)后得到所述懸浮培養(yǎng)液；所述γ-TMT基因表達載體中包含編碼γ-TMT的多核苷酸片段。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述細胞懸浮培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)液，pH?6.0-7.0，其中含蔗糖?25-30g/L、2,4-D?1.0-1.5mg/L、水解酪蛋白200-300mg/L；接種量為1-2g/50mL；暗培養(yǎng)15-25天。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述細胞懸浮培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基，pH?6.0，其中含蔗糖?30g/L、2,4-D?1.0mg/L、水解酪蛋白200mg/L；接種量為2g/50mL；培養(yǎng)溫度為25±0.2℃；搖床轉速為110r/min。

4.根據權利要求1至3任一所述的制備方法，其特征在于：所述γ-TMT基因表達載體采用植物表達載體。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述γ-TMT基因表達載體采用PBI121載體。

6.根據權利要求1至3任一所述的制備方法，其特征在于：所述γ-TMT基因表達載體中包含的編碼γ-TMT的多核苷酸片段通過以下方法制備：

（1）提取擬南芥總RNA；

（2）以擬南芥總RNA逆轉錄得到的cDNA，利用引物TMT-F：5’-CTTGGATCCATGAAAGCAACTCTAGCAGC-3’、TMT-R：5’-CGGGATCCGAGTGGCTTCTGGCAAGTGAT-3’進行PCR擴增，即得所述編碼γ-TMT的多核苷酸片段。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于：所述γ-TMT基因表達載體通過以下步驟制備：

（1）利用pMD19-T載體連接所述編碼γ-TMT的多核苷酸片段后，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選出轉化子，進行PCR擴增，提取得到含有編碼γ-TMT的基因的克隆載體pMD-TMT；

（2）取步驟（1）得到的克隆載體pMD-TMT及pBI121載體采用BamH?I酶切后，經T4連接酶連接后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，提取得到重組質粒pBI121-TMT；所述重組質粒pBI121-TMT即為所述γ-TMT基因表達載體。

8.根據權利要求1至3任一所述的制備方法，其特征在于：所述農桿菌介導采用凍融法轉化根癌農桿菌EHA105。

9.根據權利要求1至3任一所述的制備方法，其特征在于：所述黑莓外植體細胞采用黑莓種子產生的胚性愈傷組織。