[發(fā)明專(zhuān)利]一種使用重組耶氏解脂酵母菌株生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410020846.1
• 申請(qǐng)日: 2014-01-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103725723A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳衛(wèi);張白曦;陳海琴;李敏;顧震南;趙建新;張秋香;劉小鳴;趙國(guó)忠;張灝;陳永泉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P7/64
• 分類(lèi)號(hào): C12P7/64;C12R1/73
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 向華

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。

【背景技術(shù)】

共軛亞油酸（Conjugated?linoleic?acid，CLA）是由一系列含有共軛雙鍵、具有位置和幾何異構(gòu)的十八碳二烯酸的總稱(chēng)，是必需脂肪酸亞油酸（Linoleic?acid，LA）的立體幾何異構(gòu)體，也可看作是亞油酸的次生衍生物。CLA具有多種異構(gòu)體形式，其中cis-9，trans-11-CLA（c9，t11-CLA）、trans-10，cis-12-CLA（t10，c12-CLA）兩種異構(gòu)體是含量最多并且確認(rèn)具有生理活性功能的共軛亞油酸單體。CLA作為一種新型的脂肪酸，其生理功能已逐漸被人們所認(rèn)同。CLA具有包括抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及抑制脂肪積累等對(duì)人類(lèi)健康有益的效果，并且CLA能夠提高飼料效價(jià)防霉變作用而被廣泛的研究。

因?yàn)镃LA具有多種獨(dú)特的生理功能，被譽(yù)為“21世紀(jì)的新型營(yíng)養(yǎng)素”，越來(lái)越多地引起了世界各國(guó)政府及科研工作者的重視，美國(guó)、加拿大等國(guó)已經(jīng)開(kāi)始把CLA作為營(yíng)養(yǎng)添加劑大量用于農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)。CLA正成為藥物、食品、飼料等研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。由于天然CLA主要存在于反芻動(dòng)物乳制品中，含量非常低；而通過(guò)堿催化異構(gòu)化等化學(xué)方法合成的CLA是多種異構(gòu)體的混合物，較難分離純化具有活性功能的異構(gòu)體；所以，研究生物轉(zhuǎn)化法獲得成分單一的功能CLA具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

到目前為止，c9，t11-CLA生物合成的最高產(chǎn)量是Shimizu研究小組通過(guò)Delacroixia?coronata菌株的delta-9脫飽和酶作用，以33.3mg/mL異油酸（trans-11-octadecenoic?acid，t-OA）為底物轉(zhuǎn)生產(chǎn)了10mg/mL的CLA，其中98%為c9，t11-CLA；而t10，c12-CLA生物合成的最高產(chǎn)量是江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心陳衛(wèi)研究小組構(gòu)建的重組耶氏解脂酵母菌株（CCFM-JU277-9），通過(guò)添加20g/L大豆油，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵38.5h得到CLA的最高產(chǎn)量為4g/L，其中全部為t10，c12-CLA。由于CCFM-JU277-9能夠在胞內(nèi)合成亞油酸異構(gòu)酶（PAI），并催化LA形成專(zhuān)一的t10，c12-CLA單體形式，因此增加底物L(fēng)A的含量將有助于增加t10，c12-CLA的產(chǎn)量。

因此，本發(fā)明希望通過(guò)在培養(yǎng)基中添加LA含量較高的廉價(jià)植物油、優(yōu)化植物油的添加時(shí)間及添加量，從而實(shí)現(xiàn)提高t10，c12-CLA產(chǎn)量的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[要解決的技術(shù)問(wèn)題]

本發(fā)明的目的是提供一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。

[技術(shù)方案]

本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。

所述生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法的步驟如下：

A、平板活化培養(yǎng)

使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20～32℃的條件下平板活化培養(yǎng)2～6天，得到平板培養(yǎng)物；

B、種子培養(yǎng)

使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度20～32℃與150～250rpm的條件下培養(yǎng)40～52小時(shí)；

C、發(fā)酵培養(yǎng)

按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)0.5%～2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20～32℃與150～250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵0-45小時(shí)期間添加終濃度為10～70g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)48～100小時(shí)，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500～8500rpm的條件下離心分離10～18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液；

所述的菌體使用以重量計(jì)0.70～1.00%NaCl水溶液洗滌2～3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進(jìn)行凍干；

D、由菌體提取脂肪