[發明專利]一種采用多次轉化發酵法生產含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法

有效

• 申請號: 201410020823.0
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103725722A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 陳衛;陳海琴;李敏;張白曦;趙建新;顧震南;宋元達;田豐偉;揚芹;陳永泉;張灝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C12R1/73
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 向華

1.一種采用多次轉化發酵法生產含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于該方法的步驟如下：

A、平板活化培養

使用接菌環將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養基上，然后置于恒溫培養箱中在溫度20～32℃的條件下平板活化培養2～6天，得到斜面培養物；

B、種子培養

使用接菌環挑取在步驟A平板活化培養的培養物接種到液體種子培養基中，然后置于試管中，在溫度20～32℃與150～250rpm的條件下培養40～52小時；

C、發酵培養

按照以發酵培養基體積計0.5%～2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養物轉接到液體發酵培養基中，置于發酵錐形瓶中在溫度20～32℃與150～250rpm的條件下震蕩培養使重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進入第一個生長穩定期，繼續培養至葡萄糖濃度下降至0.1g/L；接著往該發酵培養基中第一次補加葡萄糖，使該發酵培養液中葡萄糖濃度達到10g/L～20g/L，繼續培養使重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進入第二個生長穩定期，至葡萄糖達到0.1g/L；然后

往該發酵培養基中第二次補加葡萄糖，使該發酵培養液達到10g/L～20g/L葡萄糖，繼續培養使重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進入第三個生長穩定期，添加終濃度為20-70g/L的乳化紅花籽油，繼續培養35-60小時，得到一種發酵培養物，它在7500～8500rpm的條件下離心分離10～18分鐘，得到一次轉化的菌體與發酵上清液；

一次轉化后的菌體用新鮮培養基重懸，然后添加終濃度為20-70g/L的乳化紅花籽油，置于發酵錐形瓶中在溫度20～32℃與150～250rpm的條件下繼續震蕩培養35-60小時，得到一種發酵培養物，它在7500～8500rpm的條件下離心分離10～18分鐘，得到二次轉化的菌體與發酵上清液；

二次轉化后的菌體再次用新鮮培養基重懸，然后添加終濃度為20-70g/L的乳化紅花籽油，并重復上述步驟，得到三次轉化的菌體與發酵上清液；

三次轉化后的菌體再次用新鮮培養基重懸，然后添加終濃度為20-70g/L的乳化紅花籽油，并重復上述步驟，得到四次轉化的菌體與發酵上清液；

所述的多次轉化后的菌體使用以重量計0.70～1.00%NaCl水溶液洗滌2～3次，得到的洗滌液與所述的第四次轉化后的發酵上清液合并，合并的發酵上清液與前三次轉化后的發酵上清液分別用于后續處理；洗滌的菌體接著進行凍干；

D、由菌體提取脂肪

按照以mg計凍干菌體與以ml計8～12%鹽酸-甲醇溶液之比為20～50：0.5～1.5，讓步驟C所得到的凍干菌體與8～12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45～-65℃的條件下進行甲酯化2.5～3.5小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5～15分鐘，接著在5000～7000rpm的條件下離心分離2～5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作1～2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的總脂肪酸甲酯；

E、由發酵上清液提取脂肪

按照以ml計發酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0～12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發酵上清液2～4次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8～12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45～65℃的條件下進行甲酯化0.5～3小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5～15分鐘，接著在3000～7000rpm的條件下離心分離2～5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作1～2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的總脂肪酸甲酯。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的發酵培養步驟C如下：按照菌體量為所述新發酵培養基總體積計0.5%～2.0%，使用新發酵培養基將第三個生長穩定期后繼續發酵培養所得到的菌體制成懸菌液，再添加終濃度為20g/L-70g/L的乳化紅花仔油，繼續在溫度20～32℃與150～250rpm的條件下震蕩培養48小時，分離得到菌體與發酵上清液，按照同樣方式重復發酵培養2～4次，得到一種發酵培養物，它在7500～8500rpm的條件下離心分離10～18分鐘，得到菌體與發酵上清液；

所述的菌體使用以重量計0.70～1.00%NaCl水溶液洗滌2～3次，得到的洗滌液與所述的發酵上清液合并，合并的發酵上清液用于后續處理；洗滌的菌體接著進行凍干。