[發(fā)明專利]一種大豆小RNA基因gma-miR1510a及在鹽堿調(diào)控中的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410020733.1
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103740725A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李海燕;董園園;蔡佳軒;劉偉燦;王法微;陳歡;王南;周穎;尹海龍;趙利旦;周永剛
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 長春市東師專利事務(wù)所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是大豆中一個小RNA基因gma-miR1510a及在鹽堿調(diào)控中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物生長、發(fā)育及環(huán)境應(yīng)答是一個復(fù)雜的生理過程，是一系列基因表達調(diào)控的結(jié)果。microRNA（miRNA）作為一類內(nèi)源、非編碼小分子單鏈RNA，廣泛參與了擬南芥、水稻、玉米等植物的生長、發(fā)育等生理調(diào)控過程。甚至植物在逆境脅迫條件下，microRNA通過自身基因表達水平的變化實現(xiàn)對靶基因的剪切或翻譯抑制，從而響應(yīng)逆境脅迫。

大豆（Glycine?max）是世界上重要的糧食作物和油料作物。大豆含油量可達18?%至23?%左右。自然環(huán)境是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要制約因素，鹽堿、干旱等環(huán)境因素嚴重威脅了大豆的生長發(fā)育及產(chǎn)量。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR398等數(shù)個microRNA基因參與植物的抗逆調(diào)控機制。在植物逆境脅迫應(yīng)答中，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上與mRNA形成RISC復(fù)合體后，可實現(xiàn)對靶基因的降解或表達抑制。在擬南芥、水稻、玉米、楊樹中已克隆到參與鹽堿脅迫、磷硫缺乏、氧化、熱等物理化學(xué)脅迫調(diào)控過程的miRNA基因，gma-miR394a、gma-miR482、gma-miR1512、gma-miR1515等基因均發(fā)現(xiàn)與逆境脅迫調(diào)控有關(guān)。miRNA作為靶基因的負調(diào)因子響應(yīng)植物的逆境脅迫過程。

大豆受逆境脅迫的miRNA表達變化及調(diào)控機制研究是增強大豆耐逆境脅迫的新研究熱點。通過研究miRNA在大豆中鹽堿、干旱等逆境調(diào)控的生理生化作用，觀察逆境脅迫條件下特定microRNA的表達及作用機制，挖掘耐逆境脅迫基因資源，對培育抗逆境脅迫新品系大豆，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要的社會價值及經(jīng)濟價值。因而借助基因表達分析篩選并挖掘抗逆相關(guān)miRNA基因，進行相關(guān)的表達調(diào)控及應(yīng)用研究，為提培育優(yōu)良性狀農(nóng)作物奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種大豆小RNA基因gma-miR1510a及其前體基因。

一個小RNA基因gma-miR1510a前體基因，其堿基序列如序列表SEQ?ID?No.1所示。

一個小RNA基因gma-miR1510a，其堿基序列如序列表SEQ?ID?No.2所示。

一種小RNA基因gma-miR1510a的表達載體pCAMBIA-bar-miR1507a，它是由下述方法制備：

1）人工合成序列表SEQ?ID?No.3所示的bar基因序列；

2）用XhoI酶切bar基因序列和pCAMBIA1301，將bar插入pCAMBIA1301（購自pcambia公司）的兩個XhoI酶切位點間，替換潮霉素抗性基因；

3）用HindⅢ和BstEⅡ分步酶切質(zhì)粒，Taq酶補平末端后，用T4連接酶連接平末端；最后，將克隆的兩端帶有EcoRI的35S啟動子基因與EcoRI單酶切后的質(zhì)粒連接，獲得質(zhì)粒pCAMBIA-bar；

4）目的基因和pCAMBIA-bar用BamHI和HindIII雙酶切，連接，得pCAMBIA-bar-miR1510a。

本發(fā)明又一個目的是一個小RNA基因gma-miR1510a在培育耐鹽堿植物品種中的應(yīng)用。

一種培育耐鹽堿植物品種的方法，它包括：

1）將pCAMBIA-bar-miR1510a載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中；

2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化至植物中。

本發(fā)明提供了一種大豆中一個小RNA基因gma-miR1510a及前體基因，它來自于大豆品種吉育72，將前體基因插入經(jīng)改造的pCAMBIA1301載體中，獲得pCAMBIA-bar-miR1510a載體質(zhì)粒，將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，轉(zhuǎn)染擬南芥中，實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥提高了植物的耐鹽堿脅迫能力。

附圖說明

圖1不同脅迫條件下，大豆葉片中g(shù)ma-miR1510a在不同時間段的表達分析；

圖2?T₁代轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測結(jié)果；

圖3?T₂代轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測結(jié)果；

圖4?鹽堿條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)芽率統(tǒng)計；A：200?mM?NaCl處理；B：5?mM?NaHCO₃處理；C：5?mM?NaHCO₃+100?mM?NaCl處理；?