[發明專利]綿羊多核絨毛膜滋養層細胞的培養技術

無效

• 申請號: 201410020722.3
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103740638A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 劉淑英;王專家;張宇飛;劉慧
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種綿羊多核絨毛膜滋養層細胞的培養技術，其特征在于：具體包括以下步驟：

(1)進行多核滋養層細胞原代培養，具體過程為：

(1a)將新鮮的妊娠中期的綿羊胎盤用自來水沖洗一次，再用75％的酒精清洗3～5次，然后將其拿到經過消毒殺菌的操作間取材；

(1b)使用高壓過的手術器械，用手術剪將子宮壁剪開并將其打開，綿羊的胎盤屬于子葉型胎盤且屬于母包子型，絨毛膜滋養層所在部位為絨毛膜相嵌在肉阜內的部位，即為子葉；

(1c)使用另一套手術器械，將子葉小心地放在已經配好的含有高濃度雙抗(PS)的PBS中，反復洗2～3次；

(1d)另外取5子葉用4％的多聚甲醛和2.5％的戊二醛固定，以備后面做石蠟切片和透射電鏡標本；

(1f)傾去PBS，用高壓好的眼科剪將子葉快速的剪成糊狀，準備培養細胞；

(1g)用0.25％的胰蛋白酶37℃恒浴消化糊狀組織30min，消化期間每隔5min振蕩混勻一次，將上層不含組織的懸液轉移至一個無菌的15ml離心管中；

(1h)用膠原酶IV37℃恒浴消化組織30min，消化期間每隔5min振蕩混勻一次；

(li)兩次消化下來的細胞經過100目細胞篩子過濾，濾液細胞1200rpm離心5min；

(1j)棄去上清液，將細胞用含20％胎牛血清的DMEM完全培養基吹打起來，在渦旋振蕩器上振蕩混勻；

(1k)將細胞接種在25cm2的培養瓶中，每瓶加3ml完全培養基，放入CO₂孵化箱中，控制條件溫度37℃，CO₂濃度5.0％；

(1l)每3d換一次完全培養液，當原代細胞貼壁為培養瓶壁的90％左右時，進行傳代；

(2)進行多核滋養層細胞的傳代培養，具體步驟為：

(2a)首次傳代吸去瓶中的培養液，用PBS溶液洗培養瓶3次，棄去PBS；

(2b)加入0.25％胰蛋白酶消化細胞，放在37℃培養箱中消化2min，輕輕敲細胞培養瓶，顯微鏡下觀察貼壁細胞是否脫落；

(2c)貼壁細胞是有90％以上脫壁時，用含血清的培養基終止消化1200rpm離心5min，棄上清；

(2d)加入1ml完全培養基制成單細胞懸液，將細胞懸液按1∶2進行傳代并做標記P1代，放入CO₂孵化箱中培養，控制條件溫度37℃，CO₂濃度5.0％；

(2e)待細胞再次長滿培養瓶時進行二次傳代，方法與首次傳代一樣，以此做法待細胞傳代三次后，制作滋養層細胞爬片，以備鑒定；

(3)針對上述制備細胞進行檢測分析，具體為：

(3a)H·E染色，具體為：

①胎盤子葉組織切片H·E染色：將固定好的子葉經過自來水洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切片4μm，脫蠟、水化，HE染色；染色完成后中性樹膠封片，顯微觀察并照相；

②滋養層細胞爬片H·E染色：待傳代2次的滋養層細胞長滿經多聚賴氨酸處理過的蓋玻片時，將玻片用PBS液洗3次，950mL/L的乙醇固定20min后，PBS洗2次，每次1min；蘇木素染色15min，自來水洗2min，鹽酸酒精分化4s，伊紅染色1～2min；然后經脫水、透明后中性樹膠封片，顯微觀察并照相；

(3b)免疫組織化學，包括：

①胎盤子葉免疫組織化學檢測：石蠟切片經自來水洗、二甲苯脫蠟和梯度酒精水化到蒸餾水后，PBS洗2次，每次5min；滴加30mL/L的H₂O₂，消除其內源性過氧化物酶的活性；PBS洗2次，每次5min，進行抗原修復，在煮沸后的檸檬酸鈉抗原修復液中高熱微博修復15min，自然冷卻至室溫；PBS洗2次，每次5min，滴加適當比例(1∶300)稀釋的一抗(CK7)，4℃孵育過夜；然后將切片放在37℃溫箱內孵育1h，PBS洗2次，每次5min，滴加即用型MaxVisionTM試劑，室溫下孵育20min；PBS洗2次，每次5min，滴加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5min；最后核復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照；陰性對照試驗用PBS代替一抗染色步驟同上；

②滋養層細胞爬片免疫組織化學檢測：取對數生長期的滋養層細胞，消化制成單細胞懸液，接種于預先放置有蓋玻片的培養液中待細胞接近長成單層后，取出蓋玻片PBS液漂洗3次，4％多聚甲醛固定15min；PBS液沖洗3次，每張滴加50μl3％H₂O₂，室溫下孵育10min，以阻斷其內源性過氧化物酶的活性；沖洗3次，除去PBS液，每張滴加50μl鼠抗羊CK7，4℃過夜；PBS液沖洗3次，除去PBS液，每張滴加50μl即用型MaxVisionTM試劑室溫下孵育15min；PBS液沖洗3次，除去PBS液，每張滴加100μl新配制DAB溶液，顯微鏡下觀察3-5min；自來水沖洗，經過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察并拍照；陰性對照試驗用代替一抗染色步驟同上；

(3c)透射電鏡法檢測：

將傳代3次的長滿細胞培養瓶壁的滋養層細胞用細胞刮子刮下來，用PBS液洗2次，把細胞收集到15ml離心管中，2000g/min，離心10min，將細胞離心成團；棄上清，用2.5％的戊二醛固定液預固定1h以上，將預固定的細胞2000g/min，離心10min；棄上清，用PBS液洗2次，離心2次，每次1600rpm離心5min；將配好的2％的瓊脂水溶液保持在50～55℃之間，并將上述離心細胞溫浴至50℃；用熱吸管吸取熱瓊脂2ml到細胞團中，迅速吹打均勻，立即4000rpm，離心5min；待瓊脂凝固后取出，放入2.5％的戊二醛固定液中靜置，放入4℃冰箱中備用；將經過2.5％戊二醛固定液固定好的綿羊子葉組織塊，修成適合制作電鏡標本比例大小的組織塊；然后用10mg/L四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，超薄切片光學定位并切片，醋酸鈾及枸櫞酸雙重染色，透射電鏡觀察滋養層細胞超微結構并照相。