[發明專利]丁布誘導型玉米螟OfCYP啟動子及活性分析

有效

• 申請號: 201410020531.7
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103834659A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 尚慶利;潘怡歐;楊晨;席景會;楊巽;畢銳
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/79
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

技術領域

本發明屬生物工程技術領域，涉及一段DNA序列，它可以作為啟動子調控基因的表達。具體涉及一種來源于玉米螟P450基因（GenebankNo.EU807990）并在細胞中高度表達的誘導型啟動子序列。?

背景技術

玉米螟是一種重要的世界性農業害蟲，通過米心葉期幼蟲取食葉肉或蛀食未展開的心葉，造成“花葉”，抽穗后鉆蛀莖稈，致雌穗發育受阻而減產，蛀孔處易倒折。穗期蛀食雌穗、嫩粒，造成籽粒缺損霉爛，品質下降。玉米在生長發育過程中產生許多次生物質，其中有些對害蟲有明顯的防御功能，影晌害蟲的行為、生長發育和生殖。丁布為氧肟酸類中最重要的一種，在我國有人稱之為玉米植抗素，它能抑制歐洲玉米螟幼蟲的生長，增加幼蟲死亡率，使得幼蟲期和蛹期延長，導致蛹重下降，成蟲繁殖力降低。丁布導致近似消化能力降低和攝取食物轉化率降低。已有研究結果表明，丁布可以誘導玉米螟細胞色素P450基因OfCYP（gene?bankNo.EU807990）高表達。這可能是玉米螟利用丁布作為化學感應信號來啟動其防御機制進而應對丁布脅迫的重要生理機能。同時這也顯示出玉米螟OfCYP基因啟動子極可能具有較高誘導活性，迄今為止，未有從玉米螟中分離的誘導型高活性啟動子。目前能應用于真核表達研究的丁布誘導型玉米螟啟動子還未有。因此，對于新的高活性的丁布誘導型玉米螟相關啟動子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉錄因子的研究具有重要意義,對深入研究害蟲植物次生物質耐受性機制及新型抗蟲新品種的研制奠定基礎。?

發明內容

本發明的一個目的是提供一種丁布誘導型玉米螟OfCYP啟動子序列，該啟動子序列能夠誘導目的基因高水平表達，而且該啟動子來源于玉米螟P450基因OfCYP。?

本發明的第二個目的是提供一種用于真核細胞轉染的玉米螟OfCYP啟動子真核表達載體，該載體指導高水平表達目的基因OfCYP的啟動子序列和5'非翻譯區。?

本發明的第三個目的是提供一種所述真核細胞表達載體的表達，該載體的表達能反映啟動子活性的高低。?

為實現上述目的，本發明克隆了玉米螟P450基因OfCYP的啟動子區，并構建了真核表達載體，所述載體包含帶有OfCYP基因的5'非翻譯區的上述啟動子。隨后利用所述載體在Sf9細胞中表達，并檢測到該啟動子的高水平活性。?

本發明提供一種獲得的丁布誘導型玉米螟OfCYP啟動子序列，所述啟動子序列如SEQID?NO:1所示，其中SEQIDNO：1的-1bp至-393bp區（見序列表）為丁布誘導型玉米螟OfCYP啟動子DNA序列，在真核細胞中本發明所述的啟動子高水平活性。?

獲得的丁布誘導型OfCYP啟動子序列源自玉米螟P450基因OfCYP。?

SEQIDNO:1的+1bp至+268bp區（見序列表）為玉米螟蚜P450基因OfCYP的5’非翻譯區的DNA序列，本發明所述的玉米螟OfCYP基因的5'非翻譯區能在Sf9細胞中通過增強目標外源基因的翻譯效力，而誘導目標基因的高水平表達。?

為實現另一個目的，本發明提供一種用于細胞系轉染的真核細胞表達載體，所述真核細胞表達載體包含丁布誘導型玉米螟OfCYP啟動子序列。?

上述用于Sf9細胞轉染的真核表達載體是指能夠在細胞中瞬時、高水平表達外源基因的載體。例如pGL3載體、pGL4載體。?

一種用真核細胞表達載體的表達，所述真核細胞表達包含丁布誘導型玉米螟OfCYP啟動子序列。?

關于本發明所述的用于真核細胞的表達載體（pGL3），所述的玉米螟OfCYP基因的啟動子和5'非翻譯區在表達載體中位于外源基因（Luc+）的前面。本發明提供通過插入本發明所述的玉米螟OfCYP基因的啟動子和5'非翻譯區至含有Luc+報告基因的載體中而構建的pGL3-OfCYP(-393/+268)。但是，所述Luc+報告基因是外源基因，并預期可以用任意其它有用的外源基因來代替。?

本發明提供來自玉米螟OfCYP基因的啟動子和5'非翻譯區，根據本發明的啟動子和5'非翻譯區使得能夠在真核細胞中進行高水平的表達。?

本發明的有益效果在于：可用于真核基因的高效表達，應用于獲得低豐度基因研究，使其獲得高水平、穩定表達，對于目的功能研究具有積極意義。?

附圖說明

圖1為桃蚜基因組電泳圖?

圖2為GenomewalkerPCR電泳圖?

圖3為OfCYP連T載酶切鑒定電泳圖?