[發(fā)明專利]小麥矮腥黑穗病TCK及其近似種TCT的冬孢子圖像鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410020395.1
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN103745231B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧?yán)^忠;袁之報;金濟;胡昕安;林偉森;李山
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G06K9/62
• 分類號: G06K9/62;G06T7/00
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司44245
• 代理人: 楊曉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及小麥矮腥黑穗病鑒定的技術(shù)領(lǐng)域，尤其是指一種小麥矮腥黑穗病TCK及其近似種TCT的冬孢子圖像鑒定方法。

背景技術(shù)

小麥的矮腥黑穗病（Tilletia?controversa?Kühn，TCK）對小麥的生產(chǎn)、加工與食用危害極大，是一種易于傳播、難以防治的國外常見病害，至今已傳播至歐洲、美洲、亞洲、非洲的31個國家。一般矮腥黑穗病發(fā)病田塊小麥可減產(chǎn)10-20％，嚴(yán)重的減產(chǎn)50％以上，甚至絕收。混雜于入境小麥籽粒間的黑粉菌粒和冬孢子是TCK進行國際間傳播的重要方式。入境小麥?zhǔn)荰CK傳入中國的一個重要渠道，當(dāng)病麥進口后，這些病菌將不可避免地沉降于裝卸、運輸、貯存、加工各環(huán)節(jié)所在地；TCK具有極強抗逆性，其冬孢子在土壤中能存活多年，是極難防治的病害，且對不同地域氣候具有廣泛的適應(yīng)性，中國的部分小麥產(chǎn)區(qū)是矮腥黑穗病定殖擴散的中、高危區(qū)，TCK已被列入我國進境植物檢疫性有害生物名錄中，采取有效檢驗方法以降低小麥矮腥黑穗病菌傳入的可能性是風(fēng)險管理的首選措施。

TCK檢疫鑒定的關(guān)鍵在于將其與它們各自的近似種如網(wǎng)腥黑穗病菌（Tilletia?caries（DC.）Tul.，TCT）加以區(qū)分，網(wǎng)腥黑穗病則是國內(nèi)小麥矮腥黑穗主要病害。但是，TCK與TCT冬孢子在形態(tài)學(xué)上較為相似，且表面都有網(wǎng)紋，由此給檢疫帶來了很大難度。目前，TCK病菌的鑒定方法主要是TCK形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定。

在分子生物學(xué)鑒定方法方面，利用了rDNA堿基序列的ITS區(qū)段，該區(qū)段既具保守性,又在科、屬、種水平上均有特異性序列，通過對ITS區(qū)進行PCR及測序后，再設(shè)計特異性引物，可以來鑒定小麥矮腥黑穗病菌，以區(qū)分鑒定TCK與TCT，也有利用IGS區(qū)進行同類研究。Kochanov?M.等（2004年）、梁宏、張國珍等（2005年）、Zouhar?M.等（2010年）等均采用該類方法進行了研究，以區(qū)分鑒定TCK與TCT，梁宏、彭友良等（2006年）還利用IGS區(qū)進行了同類研究。陳萬權(quán)等（2005年）申請了專利“小麥矮腥黑粉菌檢測的一種PCR方法”（專利號200510080073.7），高利等（2009年）申請專利“一種小麥矮腥黑粉菌的檢測方法及特異性SCAR標(biāo)記”（申請?zhí)?01110051411.X）。

在顯微鏡下的形態(tài)學(xué)與自發(fā)熒光顯微學(xué)特性鑒定方面，國內(nèi)外研究者對TCK及其近似種的冬孢子在顯微鏡下進行過觀察與描述，試圖用形態(tài)學(xué)特征進行鑒別，如Holton,1949年；Duran和Fisher,1961年；Ainsworth,1965年；章正，1980年；梁再群等，1982年；Waller&Mordue，1983年；Zhang?et?al.，1984年；Aggarwal?et?al.，1990年；章正等，1995年；Castlebury&Carris,1999年。中美雙方曾于1989～1992年進行聯(lián)合試驗，對TCK和TCT的自發(fā)熒光顯微學(xué)特性及比較形態(tài)學(xué)做了研究，認為自發(fā)熒光顯微學(xué)特性和網(wǎng)脊高度可以用于這兩種菌的判別與鑒定。依據(jù)國內(nèi)外研究成果，我國在1999年發(fā)布了推薦的國家標(biāo)準(zhǔn)《植物檢疫小麥矮化腥黑穗病菌檢疫鑒定方法》，將TCK的冬孢子形態(tài)學(xué)特征作為重要的鑒定依據(jù)。在TCK鑒定時，通過油鏡在監(jiān)視器屏幕上（或用目鏡測微尺）求出每個冬孢子平均網(wǎng)脊高度值作為鑒定依據(jù)。

利用圖像分析技術(shù)并依據(jù)冬孢子的形態(tài)學(xué)特征進行鑒定。陳克（1998年）等為解決顯微鏡下人工測量TCK冬孢子網(wǎng)脊值存在的人為因素的影響問題，以顯微鏡、攝像頭等建立了一個計算機視覺系統(tǒng)，能夠采集冬孢子圖像并分析其網(wǎng)脊值，以此作為鑒定依據(jù)。Kim?D.Linder等（1998年），利用顯微鏡、CCD攝像機、電動平臺及計算機等組成了一套機器視覺系統(tǒng)，系統(tǒng)能自動搜索小麥矮腥黑穗病菌圖像中的疑似冬孢子的目標(biāo)，然后由經(jīng)過培訓(xùn)的技術(shù)人員進行審核。D.Chesmore等（2003年）采用圖像分析技術(shù)來鑒定TIM與其近似種T.walkeri?等，研究中通過圖像分析確定冬孢子的位置，計算了其表面積、周長、棘狀突起的數(shù)量與突起尺寸、最大和最小半徑、長寬比和圓形度等8個形狀參數(shù)，最后利用主成分分析法進行分類鑒定。2011-2012年，鄧?yán)^忠、李敏、袁之報、金濟等以小麥腥黑穗病菌（TCK、TCT及TIM）冬孢子顯微圖像作為對象，研究了冬孢子的圖像分割，提取了冬孢子圖像的16個形狀和紋理特征，并從中選擇了6個典型特征，分別用最小距離法、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和支持向量機分類器等模式識別方法進行了分類試驗。