[發(fā)明專利]一種去除病毒裂解疫苗中裂解劑的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410020316.7
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN103736087A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張偉;馬小偉;潘若文;張勇朝;安文琪;范蓓
• 申請（專利權(quán)）人: 華蘭生物疫苗有限公司;華蘭生物工程股份有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61K39/145;A61P31/12;A61P31/16
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;陳曉慶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種去除病毒裂解疫苗中裂解劑的方法。

背景技術(shù)

迄今流感疫苗產(chǎn)品主要是流感全病毒疫苗和流感裂解疫苗。流感裂解疫苗由于具有更強的免疫原性及更多的適宜接種人群而成為主要上市產(chǎn)品和新的研究熱點。在裂解疫苗的生產(chǎn)工藝中，需要加入合適濃度的裂解劑對病毒原液進(jìn)行裂解處理,再去除裂解劑，得到病毒裂解疫苗。國內(nèi)外常用的裂解劑有吐溫80、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton?X-100）等。病毒裂解程度和裂解劑的去除程度與疫苗使用的安全性及不良反應(yīng)息息相關(guān)，裂解劑的殘余含量是流感病毒裂解疫苗的主要質(zhì)控指標(biāo)之一。

目前流感疫苗生產(chǎn)工藝中，裂解劑的去除普遍采用超濾法和透析法。超濾法采用封閉系統(tǒng)，超濾膜可重復(fù)多次使用，超濾過程中還可帶走樣品中部分熱源質(zhì)，有效控制細(xì)菌內(nèi)毒素，有操作方便，易于批量生產(chǎn)等優(yōu)點。但超濾膜對抗原有吸附作用，在生產(chǎn)過程中損失一定數(shù)量的抗原，造成浪費，成本增加。而透析法生產(chǎn)用時間周期較長，費時費力，不易操作和工業(yè)放大，且使病毒原液增大體積，稀釋了血凝素的含量，常會使血凝素含量指標(biāo)達(dá)不到規(guī)程要求，還需將病毒液濃縮后才可作為疫苗原液使用。這樣既增加純化成本，又增加了疫苗原液被污染的機會。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種去除病毒裂解液中裂解劑的方法。

本發(fā)明所提供的去除病毒裂解液中裂解劑的方法，包括如下步驟：用裂解劑對病毒原液進(jìn)行裂解，得到病毒裂解液；以十八碳烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，將病毒裂解液進(jìn)行固相提取，去除病毒裂解液中的裂解劑。

上述方法中，所述固相提取的方法包括如下步驟：將所述病毒裂解液流經(jīng)所述固定相，收集流穿峰，得到去除裂解劑的疫苗。該過程中，目標(biāo)物質(zhì)與所述固相不結(jié)合，存在于流穿液中；裂解劑與固定相結(jié)合。

上述任一方法中，所述流經(jīng)的線性流速為0.75cm/min。

上述任一方法中，所述流經(jīng)的壓力為0.1-0.4bar。

上述任一方法中，所述病毒裂解液與所述固定相的比為：2000ml病毒裂解液：100ml固定相。

上述任一方法中，所述收集流穿峰為收集AU值大于等于0.06AU的流穿峰。

所述收集過程中使用紫外檢測儀監(jiān)測280nm的紫外峰吸收。

上述任一方法中，在所述收集流穿峰之后，包括如下淋洗收集步驟：

用溶液C對上樣后的固定相進(jìn)行洗脫，溶液C與固定相的配比為200ml溶液C：100ml固定相；

所述溶液C為磷酸鹽緩沖生理氯化鈉溶液，pH值為7.2；

當(dāng)峰值下降至0.06AU時，停止收集。

上述任一方法中，在所述流經(jīng)前，包括如下固定相活化步驟：

將溶液A和溶液B依次通過所述固定相；

所述溶液A與所述固定相的配比為：200ml溶液A：100ml固定相；

所述溶液B與所述固定相的配比為：300ml溶液B：100ml固定相。

所述溶液A為75%乙醇水溶液，pH值為6.8；

所述溶液B為磷酸鹽緩沖生理氯化鈉溶液，pH值為7.2。

上述任一方法中，所述病毒原液中的蛋白含量為500-1500ug/ml。

上述任一方法中，所述病毒為流感病毒；所述裂解劑為Triton?X-100。

上述任一方法中，裂解劑在病毒原液中的濃度可為0.5%（體積百分含量）。

實驗證明，本發(fā)明方法去除疫苗中裂解劑的效果明顯好于超濾法，去除率可達(dá)96%，且去除效果非常穩(wěn)定，同時，疫苗的有效成分的回收效率高，可達(dá)90%。此外，十八碳烷基鍵合硅膠的Triton?X-100最大負(fù)載量高達(dá)154g/L，同時對裂解液蛋白質(zhì)含量適用范圍較寬，Triton?X-100結(jié)合在凝膠上，目標(biāo)蛋白在流穿峰中，單批次處理量大，操作簡單，非常適宜于規(guī)?；a(chǎn)，且凝膠可再生，生產(chǎn)成本較低。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、去除流感病毒裂解疫苗中裂解劑的方法

一、流感病毒裂解疫苗的來源

本發(fā)明方法中使用的流感病毒裂解疫苗可為市售的流感病毒裂解疫苗，取其生產(chǎn)過程中全病毒液，全病毒液蛋白濃度在500-1500ug/ml之間即可，裂解過程使用裂解劑為聚乙二醇辛基苯基醚（Triton?X-100）。

本實施例中使用的流感病毒裂解疫苗是按照如下方法制備的：