[發(fā)明專利]一種脂肽檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410020272.8
• 申請(qǐng)日: 2014-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103743841A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 牟伯中;楊世忠;劉金峰;剛洪澤;朱原意
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 蔣亮珠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種脂肽檢測(cè)方法，具體是一種復(fù)雜體系中微量脂肽的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

脂肽是一類重要的生物表面活性劑，具有良好的表面活性及生物活性，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、藥品、油田開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域，目前已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。

在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，含脂肽的應(yīng)用體系一般具有如下特點(diǎn)：1)由于脂肽具有較強(qiáng)的表界面活性，脂肽用量一般較低；2)為了強(qiáng)化作用效果，通常脂肽會(huì)和化學(xué)表面活性劑、聚合物等物質(zhì)復(fù)合使用；3)復(fù)合使用的體系或待分析樣品中又往往含有機(jī)酸、烴類有機(jī)物、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)。因此，對(duì)于這樣的低含量、多雜質(zhì)并存的復(fù)雜體系，準(zhǔn)確定量分析其中的微量脂肽具有非常大的技術(shù)難度。

現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)脂肽的方法有重量法、薄層色譜法、高效液相色譜法等方法。

重量法是利用脂肽在酸性條件下可以形成沉淀的原理，通過(guò)離心分離沉淀物，干燥稱重的方法來(lái)分析脂肽的量。由于復(fù)雜體系中雜質(zhì)較多，有些雜質(zhì)本身可以在酸性條件下沉淀，重量法測(cè)定時(shí)雜質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生很大影響，導(dǎo)致誤差較大；同時(shí)，對(duì)于脂肽含量很低(10²ppm級(jí))的體系，該方法無(wú)法檢測(cè)，因此重量法是一種脂肽的常規(guī)、常量檢測(cè)方法。

薄層色譜法是采用TLC將樣品色譜分離，在層析板上得到脂肽分離的斑點(diǎn)，脂肽斑點(diǎn)采用水解及顯色劑顯色，通過(guò)定量分析斑點(diǎn)顯色情況，確定脂肽量。復(fù)雜體系中的一些化學(xué)添加劑(表面活性劑如石油磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽，微量原油等化學(xué)雜質(zhì))，可能會(huì)影響脂肽的TLC分離，同時(shí)又會(huì)干擾脂肽水解產(chǎn)物的顯色，因此，依據(jù)斑點(diǎn)顯色進(jìn)行定量分析誤差較大，甚至導(dǎo)致檢測(cè)失敗。

高效液相色譜法檢出限較高(10²ppm級(jí))，且考慮到分離效果及對(duì)色譜柱的傷害，高效液相色譜法僅適用于檢測(cè)比較純凈的脂肽樣品。而復(fù)雜體系中物質(zhì)繁雜，物質(zhì)理化性質(zhì)差異大，不僅干擾檢測(cè)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)傷害色譜柱，導(dǎo)致柱效降低，定量不準(zhǔn)。對(duì)于復(fù)雜體系中微量的脂肽，濃度低于高效液相色譜檢出限，檢測(cè)無(wú)法進(jìn)行。此外，高效液相色譜法檢測(cè)還需要脂肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而目前已知的脂肽化合物有23個(gè)族，單就考慮分子量和肽鏈部分，就有近90個(gè)不同分子化合物，如果再考慮脂肪鏈的不同，不同分子化合物的數(shù)量將更大，這進(jìn)一步加大了獲取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的難度。即使超出檢出限，因無(wú)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也無(wú)法準(zhǔn)確地定量分析。由上可見(jiàn)，現(xiàn)有技術(shù)在進(jìn)行復(fù)雜體系中微量脂肽的檢測(cè)方面，存在著檢出限高、檢出能力低、樣品要求及傷害儀器等一項(xiàng)或多項(xiàng)缺陷，無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)量檢測(cè)。

本發(fā)明利用脂肽在酸性條件下不溶，堿性條件可溶的特點(diǎn)，通過(guò)降低待檢測(cè)樣品溶液的pH，降低脂肽溶解度，在此基礎(chǔ)上采用乙醚萃取，萃取物采用堿液洗滌，將脂肽復(fù)溶到堿液中；溶解液調(diào)低pH后再次用乙醚萃取，有效地將脂肽從復(fù)雜體系中分離出來(lái)；之后將獲得的脂肽提取物水解為氨基酸，氨基酸硅烷化反應(yīng)后利用GC/MS檢測(cè)，通過(guò)定量分析其中的氨基酸(峰面積)，根據(jù)氨基酸峰面積和脂肽量的對(duì)應(yīng)關(guān)系，(脂肽中氨基酸所占的比例是確定的、已知的)，特異性地計(jì)算樣品中脂肽的量。該方法極大地提高了脂肽的檢出限，實(shí)現(xiàn)了特異性檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種可定量分析的脂肽檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種脂肽檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

a)將待檢測(cè)樣品溶液pH調(diào)為1～2，然后用乙醚萃取，萃取物用NaOH溶液洗滌溶解，調(diào)節(jié)所得溶解液的pH調(diào)為1～2，用乙醚二次萃取，得到待檢樣品中的脂肽提取物；

b)將脂肽提取物水解得到氨基酸，氨基酸進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用GC/MS檢測(cè)，色譜圖積分得到氨基酸(亮氨酸)峰面積；

c)依據(jù)氨基酸(亮氨酸)計(jì)算脂肽含量。

步驟a)所述的NaOH溶液的濃度為0.2mol/L～0.8mol/L。

步驟a)所述的pH調(diào)為1～2所用的試劑為6M?HCl。

步驟b)所述的脂肽提取物水解所用試劑為6M?HCl，水解溫度為90～110℃，時(shí)間為20～24h。

步驟c)所述的依據(jù)氨基酸(亮氨酸)計(jì)算脂肽含量為依據(jù)GC/MS檢測(cè)到的氨基酸硅烷化反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積與脂肽濃度關(guān)系曲線計(jì)算脂肽含量。