[發明專利]含N-非取代葡萄糖胺肝素六糖的制備及其純化

有效

• 申請號: 201410019945.8
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103724458A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 魏崢;梁群燾;林江慧;魏可鎂
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C08B37/10
• 分類號: C08B37/10
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明是關于制備含GlcNH₃⁺肝素寡糖的方法及其純化，屬于天然產物制備純化領域。

背景技術

硫酸類肝素中存在12種具代表性的二糖，其中含GlcNAc、GlcNSO₃殘基的二糖為主要存在形式，而帶正電荷的GlcNH₃⁺殘基的二糖含量微少，并且它的存在也因細胞與組織的來源不同而異。雖然含GlcNH₃⁺的硫酸類肝素含量微少，但它與病毒的侵入，炎癥的發生，腦組織損傷等疾病都有著密切的關系，在生物體內扮演著重要的生物學與病理生理學角色。對含GlcNH₃⁺糖類化合物結構功能的研究，在疾病治療及新糖類藥物開發方面都有重要的意義。

隨著研究的深入，對含不同結構肝素糖鏈樣品的需求也大幅增加。據以往的文獻報道，采用分離手段從生物材料中直接獲取組分均一、結構明確的糖鏈非常困難。多采用化學修飾的方法，通過改變溶劑的極性，選擇性地脫除肝素長鏈上不同位置上的硫酸基團，從而獲得目標產物。Inoue?Y等，使用5％水(或甲醇)/二甲亞砜溶液可選擇性地脫除肝素吡啶鹽中N位上的硫酸基團；Jaseja?M等，通過pH=12.5-12.8的Na0H水溶液，α-L-艾杜糖醛酸片段上2S可以定量地脫除；Ayotte?L等，使用9:1的Me₂SO-水，Hanno?B?等使用N-甲基吡咯烷酮水溶液可選擇性脫除6S；Dulce?P?G?等使用SO₃-Py、SO₃-DMF等硫酸化試劑可在糖鏈上的不同位置進行硫酸化反應，獲得各種不同取代類型的多糖。

迄今為止，制備肝素寡糖的方法步驟繁多，價格昂貴。對硫酸類肝素酶解后得到的寡糖片段的骨架結構直接進行化學修飾的報道很少。批量獲取含GlcNH₃⁺肝素寡糖的制備方法更是罕見。本發明用易獲得的低分子量肝素為原料，簡易的方法，制備出含不同GlcNH₃⁺數目和序列的系列肝素寡糖，為硫酸類肝素中GlcNH₃⁺殘基的結構與功能及其與疾病關系的研究提供重要的糖庫。

發明內容

本發明實驗原材料為酶解的低分子量肝素。利用凝膠色譜分離不同聚合度的肝素鈉六糖混合物，除掉流動相中的NH₄HCO₃后，用SAX-HPLC方法分離收集得到各種肝素鈉六糖；脫鹽與冷凍干燥之后，利用陽離子交換和吡啶中和法制備調節洗脫液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶六糖；后用95%DMSO：5%H₂O溶劑，選擇性地脫除N位上的硫酸根，再用SAX-HPLC方法分離收集得到含不同GlcNH₃⁺數目的肝素六糖。

本發明的具體技術方案為：

一種含N-非取代葡萄糖胺肝素六糖的制備及其純化方法，其步驟為：酶解低分子量肝素利用凝膠色譜進行分離；分離后經除流動相、冷凍干燥后得到不同聚合度的肝素鈉寡糖混合物；用SAX-HPLC分離收集得到高度硫酸化的肝素鈉六糖；把收集到的肝素鈉六糖經脫鹽與冷凍干燥之后，通過陽離子交換，再用吡啶中和洗脫液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶六糖?；將肝素吡啶六糖用DMSO：H₂O（v/v）=95：5溶劑溶解，選擇性地脫除N位上的硫酸根，再用SAX-HPLC方法分離收集得到含不同GlcNH₃⁺數目的肝素六糖?，經除鹽與冷凍干燥之后得到純化的含不同GlcNH₃⁺數目的肝素六糖。?

具體步驟如下：

1）肝素鈉六糖的制備與提純：酶解低分子量肝素經過聚丙烯酰胺凝膠色譜柱，以0.2M?NH₄HCO₃為流動相,并在UV232nm下測量洗脫液的吸光度；收集肝素鈉六糖混合物的洗脫峰,?經50-60℃水浴去除NH₄HCO₃，真空冷凍干燥后得到肝素鈉六糖混合物；利用SAX-HPLC，在不同NaCl濃度下線性梯度洗脫，分離收集高度硫酸化的肝素鈉六糖粗品;把收集到的肝素鈉六糖粗品在超純水中透析3天后，冷凍干燥;