[發明專利]耐鹽并具有低溫生物脫氨功能的枯草芽孢桿菌及其應用

有效

• 申請號: 201410019773.4
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN103773722A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 周長林;賈源賓;張寧
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學;南京曜動節能環保科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C02F3/34;C12R1/125;C02F101/16
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 孫立冰

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種在低溫條件下具有高脫氨活性的細菌﹑培養該細菌的方法﹑以該菌為主要組成成分的低溫生物脫氨劑的制備﹑及運用該制劑在水體氮素降解中的應用。

背景技術

氮素循環是自然界中最為重要的生態系統物質循環的組成之一。然而，氮肥的使用及高密度水產養殖的發展，在帶來巨大經濟效益的同時也造成了嚴重的環境問題。在水產養殖中，因氮磷元素含量過高而造成的富營養化情況頻繁出現，除使水質惡化及破壞其中的生物平衡外，其中的氨氮和亞硝態氮對養殖動物具有較強毒性，特別是氨氮（NH₄⁺—N），它能直接或間接影響魚類的生長﹑繁殖乃至死亡，一方面它能被植物直接吸收利用，增加浮游生物量，為魚類提供更豐富的營養餌料。另一方面它對魚類及其他水生動物有毒性，它能破壞鰓組織，并滲進血液中，降低血液載氧能力，使呼吸機能下降。

已有研究報道表明假絲酵母、諾卡氏菌、光合細菌、硝化細菌等對養殖水體中的氨氮具有較強的去除能力，但存在接種量大、應用成本高等缺點，而芽孢桿菌易分離、易培養，該類微生物不僅可產生多種胞外水解酶，分解水中殘留的有機物，還可產生休眠芽孢，能夠抵御惡劣環境，方便制劑加工和儲運，在降低水體氨氮含量和調節水質方面有良好的應用前景。

枯草芽孢桿菌除了對氨氮有較好的脫除能力外，還能產生大量的胞外酶類，從而大量消耗池塘中的殘餌和動物排泄物等大分子有機質。大分子有機質被分解為小分子有機酸、氨基酸等物質，能為水體中光合細菌、藻類以及其它浮游生物提供營養，客觀上促進了微生態環境的穩定；芽孢桿菌還可使水生動物的腸道pH降低，產生較強活性的蛋白酶和淀粉酶，促進水生動物的消化；此外，芽孢桿菌定植在目標動物腸道中，經生物奪氧作用，能抑制病原菌的滋生以及提高動物的免疫力，最終預防疾病的發生，最終促進目標動物生長和提高飼料轉化率。

目前已報道的枯草芽孢桿菌大多存在氨氮的脫除能力不強，對環境溫度要求高（25℃以下氨氮脫除能力不強），菌株存活率不高，生產成本大，菌株在高鹽度水體中脫氮活性低等問題，影響了枯草芽孢桿菌在環境保護中的應用。

發明內容

本發明公開了一株具有低溫脫氨生物活性的細菌：枯草芽孢桿菌DA-1，該細菌具有較高的氨氮脫除能力。這類菌株是好氧細菌，在生物脫氮中能有效地將NH₄⁺-N直接轉化成菌體的自身組成物質，更具體地，這類細菌是芽孢桿菌屬的一類細菌，由發明人在江蘇省南京市鐘山風景區琵琶湖畔采集的土壤中篩選得到。本發明公開的細菌是枯草芽孢桿菌DA-1，分類命名：枯草芽孢桿菌，Bacillus?subtilis。其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號是：CGMCC?No.8292。保藏時間：2013年10月08日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學研究微生物研究所。

在低溫條件下，本發明的DA-1仍具有較高的氨氮脫除能力。

本發明的DA-1可以在15～30℃，120～250r/min的搖瓶轉速，pH5～10的條件下，在每升含10～25g葡萄糖、1～3g可溶性淀粉、10～40g黃豆餅粉、20～40mg硫酸錳、0.1～0.4g酵母膏、0.1～0.3g三氯化鐵和0.1～0.3g碳酸鈣的培養基中進行培養。

更優選的培養方法是：本發明的DA-1在30℃，200r/min的搖瓶轉速，pH7.0的條件下，在每升含15g葡萄糖、2g可溶性淀粉、30g黃豆餅粉、30mg硫酸錳、0.2g酵母膏、0.1g三氯化鐵、0.1g碳酸鈣的培養基中。

上述培養基中，滅菌條件優選：121℃滅菌20min，葡萄糖單獨115℃滅菌15min后加入無菌培養基中。固體培養基中需加入1.5%瓊脂粉。本發明所述百分比均為重量百分比。

本發明還公開了DA-1的高密度發酵方法，通過液體深層發酵，該細菌能夠形成大量芽孢，在氨氮污染水體中單獨使用該生物脫氮劑可有效脫除水體中氨氮。

本發明公開了一種大規模高密度培養低溫脫氨芽孢桿菌DA-1的方法，包括：在30℃，攪拌轉速200～300r/min，通氣量0.3～0.8vvm，接菌量3～6%，初始pH7.0的條件下，在每升含10～25g葡萄糖、1～3g可溶性淀粉、10～40g黃豆餅粉、20～40mg硫酸錳、1～3g磷酸氫二鉀、1～2g磷酸二氫鉀、0.2～1.0g硫酸鎂、0.1～0.5g酵母膏、0.1～0.3g三氯化鐵和0.1～0.3g碳酸鈣的培養液中進行發酵罐培養細菌。