[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的雙抗體夾心法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410019623.3
• 申請(qǐng)日: 2014-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103760351A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐麗廣;胥傳來(lái);孔德昭;匡華;馬偉;宋珊珊;劉麗強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/577
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/577;G01N21/78
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及了一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的雙抗體夾心法，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus）是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，雖然近年來(lái)不斷有新型的金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal?enterotoxin，SE）被發(fā)現(xiàn)，但腸毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒占金黃色葡萄球菌食物中毒的95%，葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒以A型居多，D型次之。從生牛乳、生肉及乳酪中分離的金黃色葡萄球菌以產(chǎn)生D型腸毒素為主。

在食品加工過(guò)程中，經(jīng)過(guò)熱處理可以殺滅金黃色葡萄球菌，然而一旦菌體產(chǎn)生外分泌的腸毒素，那么存在于食物中的腸毒素非常穩(wěn)定，100℃?30min不被破壞，攝入人體后可以抵抗腸胃液中蛋白酶的分解，并引起人體的嘔吐、腹瀉等癥狀。2011年我國(guó)公布速凍面米制品新國(guó)標(biāo)GB19295—2011，金黃色葡萄球菌由原來(lái)的不得檢出變?yōu)橄蘖繖z出，因此為了杜絕食品中金黃色葡萄球菌活菌數(shù)合格而腸毒素超標(biāo)的情況，腸毒素的快速檢測(cè)對(duì)于保障食品安全具有更加重要的意義。

近年來(lái)，ELISA憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點(diǎn)越來(lái)越多地用于腸毒素的檢測(cè)，雖然膠體金試紙條具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、不需要借助專(zhuān)門(mén)儀器、適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，但ELISA比膠體金試紙條具有更好的靈敏度，而且更適合高通量檢測(cè)，因此ELISA也具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

(一)要解決的技術(shù)問(wèn)題

??本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的雙抗體夾心法，建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡(jiǎn)單的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，用于食品中SED的批量、快速檢測(cè)。

(二)技術(shù)方案

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D（SED）的雙抗體夾心法，該方法包括對(duì)檢測(cè)方法的優(yōu)化。

其中，單克隆抗體是采用重組SED經(jīng)過(guò)特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。

其中，用于配對(duì)的抗體是通過(guò)優(yōu)化參數(shù)下夾心法配對(duì)，并通過(guò)多次試驗(yàn)篩選確定的，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)。

其中，建立的夾心法優(yōu)化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋濃度。LOD達(dá)到0.006ng/mL，R²為0.992。

本發(fā)明方法的檢測(cè)分析原理是：

酶標(biāo)板上包被了包被抗體5F2，即CGMCC?No.7212，合適的濃度下可以最大限度捕獲SED；洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液200μL封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn)；洗板3次，加入樣品及對(duì)照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶標(biāo)抗體10F1-HRP，即CGMCC?No.7213-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入顯色液顯色15min。如果樣品中SED濃度≥0.02ng/mL，那么樣品中SED被包被抗體捕獲并與酶標(biāo)抗體10F1-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值，并被判定為陽(yáng)性；如果樣品中SED濃度＜0.02ng/mL，那么樣品中SED不被捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號(hào)，被判定為陰性。

（1）SED單克隆抗體的制備

?????以重組表達(dá)的SED（北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供）為免疫原，免疫?8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)免疫、細(xì)胞融合、篩選，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株；

（2）單克隆抗體的配對(duì)篩選

將純化后的10株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)，配對(duì)參數(shù)如下：包被抗體5μg/mL；包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度30ng/mL標(biāo)品稀釋液0.01M、pH7.2?的PBS；酶標(biāo)抗體稀釋800倍使用；在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了11對(duì)P/N值>10的配對(duì)；

（3）夾心法的建立

選擇檢測(cè)限最穩(wěn)定的配對(duì)，即以5F2為包被抗體，以10F1作為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下：

抗體包被濃度：1μg/mL，

包被液：0.01M、pH9.6碳酸鹽緩沖液，

標(biāo)品稀釋液：0.01M、pH7.2?的PBS，

檢測(cè)抗體濃度：1μg/mL，

反應(yīng)時(shí)間：包被、封閉37℃，2h；標(biāo)準(zhǔn)品，37℃，1h；檢測(cè)抗體37℃，1h；顯色15min；

優(yōu)化后SED夾心法，LOD：0.006ng/mL，檢測(cè)限0.02ng/mL。