[發明專利]用于檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的多重PCR引物、探針和基因芯片

無效

• 申請號: 201410018956.4
• 申請日: 2014-01-14
• 公開（公告）號: CN103695566A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 徐超;張勤;楊娜;張子宏;李珂;苗麗
• 申請（專利權）人: 徐超
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 童冠章

技術領域

本發明涉及用于檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的多重PCR引物、探針和基因芯片，屬于動物病毒檢測技術領域。

背景技術

我國已經成為世界上最大的皮毛進口國，進口皮張來源廣泛。但是由于各國皮毛動物養殖狀況不同，動物疾病的流行情況不同等原因，導致進口皮張存在攜帶病毒種類繁多、性質差異大等問題。目前，進境皮毛中攜帶的RNA病毒主要有藍舌病病毒（Bluetongue?virus，BTV）、口蹄疫病毒（Foot?and?mouth?disease?virus，FMDV）、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine?viral?diarrhea?virus，BVDV）等3種病毒。這些病毒危害嚴重，通過皮毛傳播的風險較高，因此對BTV、FMDV、BVDV等3種病毒進行快速、高通量檢測，防止其通過進境皮毛入境，對于保護皮毛產業健康發展具有重要意義。迄今為止，國內外只有零星的幾篇對皮毛攜帶一種或兩種的病毒的檢測方法的報道。檢測方法主要依靠經典的血清學和PCR法，缺少對皮毛攜帶病毒的高通量檢測方法，已經無法適應進出口皮毛快速、大批量的檢測要求。

基因芯片（gene?chip），又稱基因微陣列（gene?microarray），是20世紀90年代發展起來的前沿生物技術，該技術可對樣品進行快速、準確、高效的檢測，具有高通量、多樣性、微型化以及自動化等特點，適用于大批量樣品的快速診斷。因此開發一種能夠快速、準確、高效、靈敏檢測BTV、FMDV、BVDV的基因芯片具有重大意義。

發明內容

針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種用于檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的多重PCR引物、探針和基因芯片，能夠高通量、靈敏、準確檢測進口皮毛中攜帶的RNA病毒。

本發明解決的技術方案是，用于檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的多重PCR引物和探針，所述多重PCR引物和探針為SEQ?ID?NO.1至SEQ?ID?NO.9所示的核苷酸序列；其中，檢測藍舌病病毒的正向引物和反向引物分別為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列，檢測藍舌病病毒的探針為SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列；檢測口蹄疫病毒的正向引物和反向引物分別為SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5所示的核苷酸序列，檢測口蹄疫病毒的探針為SEQ?ID?NO.6所示的核苷酸序列；檢測牛病毒性腹瀉病毒的正向引物和反向引物分別為SEQ?ID?NO.7和SEQ?ID?NO.8所示的核苷酸序列，檢測牛病毒性腹瀉病毒的探針為SEQ?ID?NO.9所示的核苷酸序列。

所述檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的正向引物的5’端標記TAMARA熒光基團。

所述檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的探針的5’端加T堿基補足35bp，并在5’端對探針進行氨基化修飾。

本發明所解決的技術方案還在于提供一種用于檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的基因芯片，所述基因芯片包括固相載體、點樣質控探針、陽性雜交質控探針、檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的多重PCR引物和對應的探針；其中，點樣質控探針為SEQ?ID?NO.10所示的核苷酸序列；陽性雜交質控探針為SEQ?ID?NO.11所示的核苷酸序列。

本發明的固相載體可以為帶有活性基團的玻璃基片，也可以為本領域常用的其他基片。

本發明檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的方法，包括以下步驟：

（1）檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹瀉病毒的多重PCR引物的設計與合成

在NCBI上查找藍舌病病毒（BTV）、口蹄疫病毒（FMDV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）等3種病毒的基因組序列，并BLAST分析比較，利用Prime5.0軟件分別設計3種病毒的引物和探針。每條正向引物的5’端標記TAMARA熒光基團，探針堿基長度小于35bp的探針5’端加T堿基到35bp，并在5’端對探針進行氨基化修飾，引物和探針的合成和標記由寶生物工程（大連）有限公司合成。同時，設計的點樣質控探針、陽性雜交質控探針、3種病毒的多重PCR引物和探針的核苷酸序列如下：

（2）基因芯片的制備