[發明專利]一種α-地中海貧血熒光定量PCR檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410017845.1
• 申請日: 2014-01-15
• 公開（公告）號: CN103757111A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 戴立忠;付亞成;鄧中平
• 申請（專利權）人: 湖南圣維爾醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;歐穎

1.一種α-地中海貧血熒光定量PCR檢測試劑盒，其包括3種PCR反應液，所述3種PCR反應液中均含有用于靶多核苷酸擴增的引物，其中，

PCR反應液Ⅰ：含有源于人基因組16號染色體α1和α2基因的保守區域的用于檢測α-地中海貧血SEA缺失的引物，且所述引物的序列為，

上游引物α-SEA-F：5’-TCAGCCACCCGCAGACCAAGACCTA-3’；

下游引物α-SEA-R：5’-AGACAGCGTCACCCTCAGAGCCAT-3’

PCR反應液Ⅱ：含有源于人基因組16號染色體α1基因的保守區域的用于檢測α-地中海貧血3.7缺失的引物，且所述引物的序列為，

上游引物α-3.7-F：5’-GGGGTGTCACAGTGAACCACGACC-3’；

下游引物α-3.7-R：5’-GCCCCTGCCTTTTCCTACCCTATCC-3’；

PCR反應液Ⅲ：含有源于人基因組16號染色體α2基因的保守區域的用于檢測α-地中海貧血4.2缺失的引物，且所述引物的序列為，

上游引物α-4.2-F：5’-GGCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’；

下游引物α-4.2-R：5’-GGGCGGCTCCAGATTCAGACTCCT-3’。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述3種PCR反應液中均含有SYBR?GREEN染料、PCR反應緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、脫氧尿嘧啶核苷三磷酸及參比染料。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，每種所述PCR反應液中含SYBR?GREEN?I染料、10×PCR反應緩沖液、0.1～0.4mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸、0.1～0.4mmol/L脫氧尿嘧啶核苷三磷酸、40～200mmol/L參比染料以及0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸擴增的上下游引物。

4.根據權利要求1～3中任意一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括酶混合液和α-地中海貧血陰性對照。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述酶混合液包含濃度為1～5U/μl的耐熱DNA聚合酶和濃度為0.05～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶。

6.根據權利要求1～5中任意一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括裂解液、蛋白酶K溶液、吸附柱、漂洗液、緩沖液Ⅰ、緩沖液Ⅱ、緩沖液Ⅲ。

7.一種使用如權利要求1～6中任意一項所述的試劑盒進行α-地中海貧血熒光定量PCR檢測的方法，其包括：

步驟K，將3種PCR反應液分別與酶混合液混合后制成3種PCR混合液；

步驟L，將3種PCR混合液離心處理，然后將經過離心處理的3種PCR混合液分別加入3組反應管，并分別向含有PCR混合液的各反應管中加入α-地中海貧血陰性對照和待測樣品核酸，制成PCR反應樣品，蓋好管蓋；

步驟M，將各反應管置于熒光定量PCR擴增儀上進行熒光PCR反應，檢測并記錄樣品的擴增曲線與閾值線；

步驟N，根據樣品的擴增曲線形狀、擴增曲線與閾值線是否存在交點Ct，以及Ct值進行α-地中海貧血缺失分析；

其中，在步驟K中，PCR反應液的加入量為42～43μl/人份，酶混合液的加入量為1～2μl/人份。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟L中，每個反應管中總液體加入量為50μl，待測樣本核酸或α-地中海貧血陰性對照的加入量為3～5μl。

9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于，在步驟N中，如果樣本擴增曲線呈S型，有Ct值，且Ct值≥36，可以判為陽性；如果樣本擴增曲線平直，無Ct值顯示或無定值結果顯示，則判為陰性。

10.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括提取核酸的操作，其包括，

步驟A，裂解紅細胞及蛋白；

步驟B，去除雜質；

步驟C，洗滌；

步驟D，洗脫。