[發明專利]用于檢測肺炎支原體的PCR引物及其應用

有效

• 申請號: 201410017371.0
• 申請日: 2014-01-15
• 公開（公告）號: CN103740833A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 曲久鑫;曹彬;高宇輝
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于病原體檢測領域，涉及用于檢測肺炎支原體的PCR引物及其應用。

背景技術

肺炎支原體（Mycoplasma?pneumoniae，MP）是呼吸道感染（包括社區獲得性肺炎，CAP）中非常重要的病原體。肺炎支原體肺炎廣泛存在于全球范圍內，多為散發病例，約3-6年發生一次地區性流行，流行時間可長達1年，流行年份的發病率可以達到非流行年份的數倍，容易在學校、幼兒園及軍隊等人員比較密集的環境中集中發病。最近的一項包括亞洲地區在內的全球性CAP病原學調查結果顯示，肺炎支原體肺炎占CAP的12％，在所有非典型病原體感染所導致的CAP中所占的比例超過了50％。與大多數國外地區相比，我國肺炎支原體肺炎的發病率可能更高。有研究表明，肺炎支原體已經超過了肺炎鏈球菌，成為成人CAP的首要致病原。

據報道，大于20%的社區獲得性肺炎由肺炎支原體（MP）引起。由于肺炎支原體缺乏細胞壁，造成社區常用的β-內酰胺類抗生素對其無效，因此，為避免濫用抗生素，早期診斷尤為重要。間接診斷MP感染的抗體檢測方法已廣泛應用于臨床檢測，但是這些方法靈敏度不理想，且存在MP感染后持續陽性的現象。國外早已將PCR診斷技術應用于MP感染的診斷，但由于普通的PCR操作過程中易污染，使得假陽性率較高，臨床應用受到限制。

實時熒光定量PCR（Real-time?fluorescent?quantitative?PCR，QPCR）是在PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，1996年由美國Applied?Biosystems公司首先推出，熒光定量PCR對PCR產物的檢測原理做了很大的改進，它利用熒光染料在激發光的作用下，所釋放的熒光光能的變化來動態直接反映出PCR擴增產物量的變化，因熒光信號變量和擴增產物量成正比，通過足夠靈敏的自動化儀器對熒光的采集和分析，從而實現對起始模板定量及定性的分析。Sybr?Green?I是一種和DNA結合的熒光染料，在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射熒光信號，從而保證熒光信號的增高與PCR產物的增加完全同步。當進行實時監測時，可檢測到DNA聚合酶進行DNA合成階段熒光信號增加，而在模板變性階段熒光信號減少。因此，在每一次PCR循環終點，可通過檢測熒光來檢測擴增DNA的增加量。

此技術除了具有傳統PCR的特異性強、靈敏度高、檢測時間短等特點外，還具有以下特點：全封閉反應，無需凝膠電泳等PCR后處理，減小對環境的污染；不使用有毒試劑，操作安全；采用對數期分析，摒棄終點數據，定量準確；定量范圍寬，可達到10個數量級；儀器在線實時監測，結果直觀。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于檢測或輔助檢測肺炎支原體的引物對。

本發明所提供的引物對特異于肺炎支原體的16SrRNA基因或ATPase基因。具體而言，所述引物對為如下引物對1或引物對2或引物對3：

所述引物對1為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對；所述引物對2為由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對；所述引物對3為由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對。

進一步，組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子的摩爾比為1：1。

制備所述引物對的方法也屬于本發明的保護范圍。

該方法具體可包括將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝的步驟。

本發明是另一個目的是提供一種用于檢測或輔助檢測肺炎支原體的試劑盒。

本發明所提供的用于檢測或輔助檢測肺炎支原體的試劑盒，可為實時熒光定量PCR試劑盒，具體可含有所述引物對和如下物質中的至少一種：dNTP、DNA聚合酶和熒光染料。

在本發明中，所述熒光染料具體為SYBR?green。

制備所述試劑盒的方法也屬于本發明的保護范圍。

該方法具體可包括如下步驟：將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝后，與如下物質中的至少一種包裝于同一個試劑盒內：dNTP、DNA聚合酶和熒光染料。

在本發明中，所述熒光染料具體為SYBRgreen。

所述引物對或所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測肺炎支原體的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。