[發(fā)明專(zhuān)利]一種新型隱球菌檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410017251.0
• 申請(qǐng)日: 2014-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103740832A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴立忠;張操昊;鄧中平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南圣維爾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京聿宏知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;歐穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種新型隱球菌檢測(cè)試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的CN檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

新型隱球菌（Cryptococcus?Neoformans，CN）是一種可引起人類(lèi)嚴(yán)重感染的酵母樣病原真菌，主要引起細(xì)胞免疫功能低下者，如器官移植、長(zhǎng)期應(yīng)用激素及艾滋病(AIDS)患者并發(fā)隱球菌病。

新型隱球菌通常經(jīng)呼吸道或皮膚黏膜破損處侵入人體，血行播散至腦、骨骼和皮膚。有80%病例中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，引起慢性腦膜炎，此外，還可引起肺隱球菌病，以及其他感染，如侵害淋巴結(jié)、骨、皮膚等引起炎癥、膿腫等。臨床檢測(cè)方法主要有墨汁染色、腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)、組織病理學(xué)方法等。墨汁染色和腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)、組織病理學(xué)方法均難以計(jì)數(shù)，且需進(jìn)行創(chuàng)傷性操作，臨床應(yīng)用具有局限性。

近年來(lái)以DNA為基礎(chǔ)的PCR分子生物學(xué)檢測(cè)方法因快速、準(zhǔn)確而倍受關(guān)注，成為探索的熱點(diǎn)，主要包括巢式PCR（nest?PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time?fluorescence?quantify?PCR）等。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR在速度、操作、特異性等多方面存在眾多優(yōu)勢(shì)，因此臨床上其中新型隱球菌感染早期診斷領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛，給臨床診斷和治療帶來(lái)了重要的指導(dǎo)意義。

運(yùn)用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)新型隱球菌DNA主要包括新型隱球菌核酸提取和核酸PCR擴(kuò)增兩方面。

目前國(guó)內(nèi)臨床上主要采用機(jī)械破碎法對(duì)新型隱球菌核酸進(jìn)行提取：先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，反復(fù)高速震蕩和高速離心，再取上清為模板。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)于樣本中的PCR抑制物去除較徹底，但存在步驟繁瑣，操作時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)于操作人員技術(shù)水平要求高和需添置專(zhuān)門(mén)的設(shè)備等不足之處。

臨床上檢測(cè)CN-DNA的方法目前主要是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線(xiàn)，根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)與熒光閾值線(xiàn)的交點(diǎn)（即Ct值）以及擴(kuò)增曲線(xiàn)的形狀，可以判斷陰陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值（即定量檢測(cè)）。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線(xiàn)性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。

目前國(guó)外已有基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CN-DNA的試劑盒，但這些試劑盒的核酸提取過(guò)程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)，樣本中的DNA存在損耗，尤其對(duì)于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低。且其檢測(cè)靈敏度不高，某些弱陽(yáng)性樣本經(jīng)常無(wú)法擴(kuò)增。這些試劑盒大多缺乏完善的質(zhì)控體系，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類(lèi)產(chǎn)品更加滿(mǎn)足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。另外，受限于現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)CN-DNA檢測(cè)的引物探針序列，本領(lǐng)域還需要開(kāi)發(fā)出一種檢測(cè)CN-DNA特異性好且綜合性能優(yōu)良的PCR檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種核酸釋放劑在新型隱球菌檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化鉀20～300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2%和乙醇0.05～1%。

在本發(fā)明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領(lǐng)域常用的，例如為無(wú)菌水或TE緩沖液。本發(fā)明首次披露在CN檢測(cè)中使用含強(qiáng)蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡(jiǎn)化了該核酸檢測(cè)的步驟，而且檢測(cè)靈敏度有了很大的提高。