[發明專利]TAT-IL-24-KDEL融合蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410016426.6
• 申請日: 2014-01-14
• 公開（公告）號: CN103755814A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 孫愛友;魏東芝;張艦;王曉娟;白超剛;徐瑞;董玉國;張星
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/20;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

1.一種TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，其特征在于：將TAT穿膜肽和內質網定位信號肽KDEL分別融合到IL-24蛋白的N端和C端，構成TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；所述TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.權利要求1所述TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、構建pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重組質粒；

B、利用E.coli?BL21(DE3)異源表達SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；

C、分離純化TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；

D、體外檢測TAT-IL-24-KDEL融合蛋白對乳腺癌MCF-7細胞的促凋亡作用和融合蛋白在細胞內的定位。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟A的具體方法是，采用PCR擴增方法獲得SUMO標簽和TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的編碼基因，并采用融合PCR的方法將SUMO和TAT-IL-24-KDEL的編碼基因無縫連接，利用含有T7啟動子的pET28a(+)表達載體構建重組質粒。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟B的具體方法是，將含有pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重組質粒的E.coli?BL21(DE3)在37℃下培養，當OD₆₀₀達到0.6時，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃誘導10h，異源表達SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，融合蛋白以包涵體形式存在。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟C的具體方法是，在變性條件下，利用His標簽的親和層析分離純化SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，蛋白復性以后，用SUMO蛋白酶在融合蛋白上切除SUMO標簽并再次利用His親和層析去除SUMO標簽，分離純化TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟D的具體方法是，利用流式細胞實驗檢測純化的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白對乳腺癌MCF-7細胞的凋亡作用，利用免疫熒光實驗檢測融合蛋白在胞內的定位情況。

7.TAT-IL-24-KDEL融合蛋白在促進乳腺癌細胞MCF-7的凋亡中的應用。