[發明專利]一種霍亂弧菌分析分型試劑盒

有效

• 申請號: 201410014783.9
• 申請日: 2014-01-13
• 公開（公告）號: CN103757110A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 葛斌文;羅蕓;盧青;金大智;張政;周麗萍;葛海鵬;郭育林
• 申請（專利權）人: 無錫中德美聯生物技術有限公司;浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;曹翠珍

技術領域

本發明涉及一種霍亂弧菌分子分型檢測試劑盒，具體是涉及一種同時分析6個霍亂弧菌VNTR基因座的熒光標記復合擴增系統及等位基因分型標準物，該系統可以應用于霍亂弧菌的溯源。

背景技術

細菌性疾病一直危害著人類健康和畜牧業的健康發展，隨著生活水平的提高、人口流動的日漸頻繁，食源性細菌引起的食品安全問題已成為全球共同面對的社會公共衛生問題。而人口的增長、科技飛速發展、介入性醫療器械的普及等因素使得院內感染發生率持高不下，成為目前臨床最為棘手的難題。

細菌的鑒定、分型技術能夠根據細菌的生化特征或基因組成，分析不同來源菌株間的關系。它在了解細菌在人群中的傳播動力學、查找食物中毒的感染源，以及判定院內感染的暴發、尋找感染源和識別一些特殊的致病菌等方面有著重要的作用，所以成為流行病學調查的有力工具。

霍亂弧菌（V.cholera）是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。屬于國際檢疫傳染病。霍亂弧菌分型檢測的技術有很多，目前使用最多的檢測技術是脈沖場凝膠電泳檢測（pulsed?field?gel?electrophoresis，PFGE)，這種檢測方法對操作人員要求極高，操作繁瑣，做不到自動化、高通量檢測，所以推廣不易，只有省級疾病預防控制中心區域中心實驗室的具分型監測能力。Heidelberg?JF等在2000年，以菌株N16961為模板，完成了霍亂弧菌全序列的測定，基因組序列Vibrio?cholerae?O1biovar?El?Tor?str.N16961RefSeq?Genome（Heidelberg?JF,et?al.DNA?sequence?of?both?chromosomes?of?the?cholera?pathogen?Vibrio?cholerae.Nature2000Aug3），。

Jaran?S.Olsen等(Olsen?et?al.Journal?of?Microbiological?Methods78(2009)271–285)用兩個復合擴增體系擴增6個霍亂弧菌VNTR基因座，通過ABI310自動測序儀，對擴增結果進行檢測。數據分析結果表明，6個VNTR基因座分型結果與PFGE分型結果類似，具很好的分型能力，并且操作更簡便、快捷。多個VNTR復合擴增檢測英文縮寫為MLVA（multiple?locus?VNTR?analysis，MLVA）。

Yael?Danin-Poleg等（Yael?Danin-Poleg?et?al.Vibrio?cholerae?Strain?Typing?and?PhylogenyStudy?Based?on?Simple?Sequence?Repeats?Journal?of?Clinical?Microbiology,Mar.2007,p.736–746）對霍亂弧菌基因組的VNTR基因座進行了分析，其中9個VNTR基因座具多態性。

表1Yael?Danin-Poleg等統計的霍亂弧菌VNTR基因座及多態性

通過網上比對及實際樣本測試，發現Yael?Danin-Poleg等確定的等位基因范圍偏小，利用原范圍設計復合擴增體系，可能導致擴增產物大小的重疊，造成結果誤判。

發明內容

本發明目的是提供一種利用VNTR基因座對霍亂弧菌進行熒光標記復合擴增并進行分型的試劑盒，并解決現有技術中霍亂弧菌VNTR基因座等位基因范圍偏小導致的擴增產物重疊而會引起誤判的問題。本發明選擇了9個基因座中，多態性最高的6個VNTR基因座，根據各基因座的等位基因序列，設計引物，從而使試劑盒具有良好的分型能力。技術方案是：

一種霍亂弧菌分析分型試劑盒，包括有如下霍亂弧菌的VNTR基因座所設計的引物：VC1650、VC0437、VC0147、VCA0171、VCA0283和VC1457。

進一步，為了使分型的結果不易出現誤判，使各個基因座對應的等位基因都可以準確地被檢出，最好是要對各個基因座的引物進行分組標記，分組是：第1組，VC1650、VC0437；第2組，VC0147、VCA0171；第3組，VCA0283、VC1457。

進一步，所述的各組使用不同的熒光色進行標記，更優是第1組用FAM標記，第2組用HEX標記，第3組用TAMRA標記。