[發(fā)明專利]一種檢測(cè)尿液中4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410013923.0
• 申請(qǐng)日: 2014-01-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103776927A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣舉興;者為;王文元;段焰青;夏建軍;黨立志;陳興
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 昆明協(xié)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53108
• 代理人: 謝嘉

1.一種檢測(cè)尿液中4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）配制含有(±)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸和氘代(±)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)羧基進(jìn)行甲酯化衍生，對(duì)醇羥基進(jìn)行Mosher衍生，然后對(duì)衍生化以后的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS-MS分析;

（2）用普通健康吸煙人群尿樣中(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯濃度遠(yuǎn)大于(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的特性確定對(duì)應(yīng)構(gòu)型物質(zhì)的色譜峰保留時(shí)間，采用內(nèi)標(biāo)法分別建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線；

（3）準(zhǔn)確移取尿液樣品于試管中，加入(±)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5內(nèi)標(biāo)溶液和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，混勻后的尿液上樣到活化好的Oasis?MCX固相萃取小柱上進(jìn)行凈化，對(duì)樣品中的羧基進(jìn)行甲酯化衍生，對(duì)醇羥基進(jìn)行Mosher衍生，然后對(duì)衍生化以后的尿液樣品進(jìn)行HPLC-MS-MS檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)尿液中4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法，其特征在于該方法具體包括以下步驟：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：

以無(wú)水乙腈為溶劑，配制(±)4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)溶液，保留四位有效數(shù)字；按同樣方式配制(±)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的單標(biāo)溶液；以無(wú)水乙腈為溶劑配制含有(±)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸和(±)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；配制(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的無(wú)水乙腈溶液;配制三乙基胺的無(wú)水乙腈溶液;分別取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于HPLC-MS-MS色譜瓶中,在-20℃氮?dú)夥諊屑尤胫氐淄榈囊颐讶芤海鹗幠贸鲋潦覝胤磻?yīng)20分鐘，在氮?dú)夥諊姓婵諠饪s至干，再加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的無(wú)水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室溫下反應(yīng)過(guò)夜，然后對(duì)衍生化以后的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS-MS分析；

外消旋體4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化生成的一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體的峰面積為1:1；以HPLC-MS-MS色譜圖中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的濃度與(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的濃度之比為橫坐標(biāo)，以色譜圖中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的定量離子對(duì)峰面積與(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的定量離子對(duì)峰面積之比為縱坐標(biāo)，建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線；以同樣方法建立(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線；

（2）尿液樣品處理：

準(zhǔn)確移取尿樣于試管中，加入(±)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5溶液，再加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分混勻待用；將混勻后的尿樣上樣到已經(jīng)活化好的混合陽(yáng)離子樹(shù)脂固相萃取小柱上進(jìn)行凈化，用去離子水淋洗后抽干、稀鹽酸淋洗后抽干、甲醇淋洗后抽干，最后用甲醇：25%氨水混合溶液進(jìn)行洗脫，在氮?dú)夥諊袧饪s至干，加入無(wú)水乙醚，在-20℃氮?dú)夥諊屑尤胫氐淄榈囊颐讶芤海鹗幠贸鲋潦覝胤磻?yīng)，在氮?dú)夥諊姓婵諠饪s至干，再分別加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的無(wú)水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室溫下反應(yīng)過(guò)夜，待檢測(cè)；

（3）HPLC-MS-MS檢測(cè)條件：

液相條件：用C18色譜柱和乙腈-乙酸水溶液對(duì)樣品進(jìn)行分離；

質(zhì)譜條件：用正離子模式進(jìn)行多反應(yīng)檢測(cè),分析物特征離子對(duì)如表1；

表1?分析物特征離子對(duì)

（4）實(shí)際檢測(cè)：

使用優(yōu)化后的液相色譜分離條件，對(duì)處理好的尿液樣品溶液進(jìn)行HPLC-MS-MS檢測(cè)，使用標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線計(jì)算待測(cè)尿液樣品溶液中的(S)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸，進(jìn)而換算得到原始尿液樣品中的(S)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸的含量，再計(jì)算得到該尿樣中(S)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羥基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值。