[發明專利]一種海洋解淀粉芽孢桿菌1A的分離方法與用途

有效

• 申請號: 201410013742.8
• 申請日: 2014-01-13
• 公開（公告）號: CN103695360A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 馬桂珍;暴增海;王淑芳
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23B7/155;C12R1/07
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務所 32255
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種海洋解淀粉芽孢桿菌1A（Bacillus?amyloliquefaciens）對果品產后病原真菌的抗菌與防病用途；所述的果品產后病原真菌為：蘋果炭疽病菌(?Colletotrichum?gloeosporioides?)，葡萄白腐病菌（Coniella?diplodiella），梨鏈格孢菌(?Alternaria?kikuchiana)?，柑橘青霉菌(?Penicllium??italicum)。

2.一種如權利要求1所述用途中涉及的海洋解淀粉芽孢桿菌1A的分離方法，其特征在于，其步驟如下：

（1）樣品的采集與富集：連云港海域采集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、滸苔、跳跳魚樣品，置于采樣袋中，注明樣品名稱、采集日期以及采集地點，樣品進行如下處理：

海水樣品：采集來的海水混勻，5mL加入到裝有45mL富集培養基的250ml三角瓶中，25℃、180r/min的條件下搖床培養2d；

海泥樣品：取5g海泥放入事先滅好菌的裝有45ml的無菌海水的250ml的三角瓶中，混勻振蕩20min，取5ml樣品加入45ml富集培養基的250ml三角瓶中，25℃、180r/min的條件下搖床培養2d；

魚體樣品：魚體解剖之后，取腸道組織5g放入無菌研砵中加少量無菌海水研磨至糊狀，取研磨好的糊狀樣品5ml加入裝有45ml富集培養基的250ml三角瓶中，25℃，180r/min的條件下搖床培養2d；

貝類樣品：取其消化腺5g剪碎無菌海水浸泡過夜后，將浸泡液和消化腺放入裝有入45mL富集培養基250ml三角瓶中，180r/min，25℃條件下搖床培養2d；

滸苔樣品：用無菌海水沖洗滸苔樣品3?次，取5g沖洗后的樣品研磨至糊狀，將液體加入到富集培養基中，并于25℃、180r/min的條件下搖床培養2d；

螃蟹樣品：用剪刀剪取5g蟹肉或者消化腺于放入已經滅菌后的無菌研砵中研磨至糊狀，取研磨好的糊狀樣品5ml加入45ml富集培養基的的250ml三角瓶中，并于25℃、180r/min的條件下搖床培養2d；

（2）細菌的分離及純化：分別取1mL上述富集后的樣品放入盛有9mL無菌水的試管中，進行梯度稀釋，取10^-4、10^-5、10^-6稀釋度樣品0.2mL涂布到直徑9cm的分離培養基平板上，每個稀釋梯度重復3次；觀察并挑取形態、顏色不同的菌落，采用三區劃線方法進行純化，得到若干海洋細菌純菌株；

（3）初篩：采用平板對峙法測定海洋細菌純菌株對供試4種果品產后病原真菌的抑制作用；方法如下：PDA培養基平板中央接種直徑為8mm果品產后病原真菌菌苔，菌苔四周距離培養皿邊緣15mm處劃線接種海洋細菌純菌株，重復3次，28℃倒置恒溫培養3d，測定抑菌帶寬度，篩選得到抑菌帶寬度大于5mm的菌株；所述的4種果品產后病原真菌為：蘋果炭疽病菌(?Colletotrichum?gloeosporioides?)，葡萄白腐病菌（Coniella?diplodiella），梨鏈格孢菌(?Alternaria?kikuchiana)?，柑橘青霉菌(?Penicllium??italicum)；

（4）復篩：將抑菌帶寬度大于5mm的菌株進行搖瓶發酵制備無菌發酵液，方法如下：接種1環菌株于盛有50mL種子培養基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振蕩培養24h，調整菌液濃度為10⁸cfu/mL，作發酵用種子液；將種子液按10%的接種量接入至裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振蕩培養36h，發酵液在4℃，12000?r/min條件下離心20min，棄沉淀，上清液，用孔徑為0.22μm的細菌過濾器過濾，即得無菌發酵液；采用牛津杯法測定無菌發酵液對前述4種果品產后病原真菌的抑菌作用，篩選得到對4種果品產后病原真菌的抑菌帶寬度均大于10mm的菌株海洋解淀粉芽孢桿菌1A，該菌株分離自海水樣品；

所述的富集培養基、分離培養基、種子培養基和發酵培養基均為2216E培養基。