[發明專利]一種檢測飲用水中衛生質量和GMP工廠表面衛生的ATP生物發光試劑、方法及試劑盒

無效

• 申請號: 201410013473.5
• 申請日: 2014-01-10
• 公開（公告）號: CN103757089A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 吳慧清;吳清平;李程思;張菊梅;郭偉鵬
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所;廣東環凱微生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;C12Q1/06
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種檢測飲用水中衛生質量和GMP工廠表面衛生的ATP生物發光試劑，其特征在于，包括熒光素酶、D-熒光素、去ATP無菌處理的發光穩定緩沖系統，所述的熒光素酶必須經過純化，具體制備方法為：取天然螢火蟲蟲尾，通過添加酶提取液研磨、離心和硫酸銨沉淀得到粗酶制劑；再通過復溶、透析、超濾、離心和陽離子交換法進行純化，純化過程中的NTE緩沖液是經過去ATP處理的，進一步經一次分子排阻層析或親和層析和二次分子排阻層析，即得到純化的熒光素酶，其使得ATP生物發光試劑的發光比活力在0.4mL發光體系中，用1×10^-7mol/L?ATP測量時的相對發光對數值達到6.5～7.5；所述的D-熒光素的純度為99%以上，其在ATP生物發光試劑中的終濃度為20～150μg/mL；所述的去ATP無菌處理的發光穩定緩沖系統含10～100mg/L海藻糖、5～100mg/L?PEG、0～2.0mol/L蔗糖、0.1～2.0mol/L甘氨酸、0～2.0mol/L?DMSO、0～1mmol/L焦磷酸、25mmol/L甘氨酰甘氨酸、1.0mmol/L?EDTA、1.0mmol/L?DTT,pH7.2～7.8。

2.根據權利要求1所述的ATP生物發光試劑，其特征在于，所述的去ATP無菌處理，為用三磷酸腺苷雙磷酸酶處理后，經121℃，15min滅菌。

3.一種檢測飲用水中衛生質量的方法，其特征在于，包括以下步驟：首先復配ATP生物發光試劑：ATP生物發光試劑添加去ATP無菌處理的發光穩定緩沖系統，使ATP生物發光試劑的發光比活力在0.4mL發光體系中，用1×10^-7/L?ATP測量時的相對發光對數值達到6.5～7.5；然后通過真空抽濾將待檢水樣過0.45μm或0.22μm濾膜，棄廢液，再加2.5ml無菌超純水洗脫濾膜上的微生物，得到濃縮了100倍的樣品，測量時，每取0.1ml濃縮樣品，加入0.1mlATP提取劑EC，振勻后室溫下作用1.5～2.5min，再加入0.1mlGDB發光測試緩沖液，振勻后加入0.1ml復配后的ATP生物發光試劑，立即置于ATP生物發光檢測儀進行發光檢測，同時檢測無菌水作為對照的空白樣品發光值，樣品發光值減去空白發光值后取對數，通過發光曲線計算待測水樣中的細菌總數，細菌總數TBC=N×（505×10^{（A+BLogRLU）}）/3×10^-16（個/升），N=稀釋倍數，A，B為ATP生物發光試劑的標準ATP發光曲線測試后，ATP濃度和凈相對發光值取雙對數后獲得的線性回歸的發光方程的系數。