[發明專利]一種以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉染系統

有效

• 申請號: 201410012489.4
• 申請日: 2014-01-13
• 公開（公告）號: CN103773781A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 李建華;張西臣;武斌;宮鵬濤;信彩巖;張國才;張楠;楊舉;李赫;楊正濤
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/86;C12R1/93
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域：

本發明提供了一種以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉染系統，同時還公開柔嫩艾美爾球蟲病毒的核酸序列，屬于基因工程領域。

背景技術：

球蟲病?（Coccidiosis）是由艾美爾屬球蟲引起，且危害十分嚴重的寄生蟲病。作為一種細胞內寄生的真核生物，艾美爾球蟲導致全球養禽業的巨大損失，雖經多年研究，但迄今尚無理想的防治辦法，究其原因就是對球蟲細胞和分子生物學缺乏詳盡的了解。雙鏈RNA（dsRNA）病毒首先在真菌中于1948年發現，此后又在許多原蟲中發現了dsRNA病毒。已報道在柔嫩艾美爾球蟲、斯氏艾美爾球蟲、尼氏艾美爾球蟲、布氏艾美爾球蟲、巨型艾美爾球蟲、毒害艾美爾球蟲以及堆型艾美爾球蟲等體內電鏡觀察到病毒樣粒子，但目前關于柔嫩艾美爾球蟲病毒的核酸序列以及基于病毒的轉染系統尚未見報導。

發明內容：

本發明提供了一種以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉染系統。該轉染系統含有多克隆酶切位點，使用方便，可將多種外源基因轉入柔嫩艾美爾球蟲體內，進行柔嫩艾美爾球蟲的基因表達調控、生化代謝以及蟲苗研制等研究。

本發明提供的柔嫩艾美爾球蟲病毒的核酸序列，如SEQ?ID:1所示。

本發明公開的利用柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA作轉染載體，在柔嫩艾美爾球蟲體內進行外源基因的表達，其特征在于：

將含外源基因和多克隆酶切位點的基因替換柔嫩艾美爾球蟲病毒dsRNA的部分編碼區，并在5’外編碼區前端加入T7啟動子，后用RNA聚合酶進行體外轉錄，后將其轉錄體電穿孔至球蟲卵囊體內進行外源基因的表達。

本發明的積極效果在于：

提供了柔嫩艾美爾球蟲病毒基因組dsRNA全長cDNA序列6006bp。利用柔嫩艾美爾球蟲為真核生物，外源基因在柔嫩艾美爾球蟲體內表達出的蛋白具有活性，所以該轉染系統含有多克隆位點，為通用型轉染載體，多種外源基因可在柔嫩艾美爾球蟲體內表達，為研究球蟲類原蟲的分子生物學、細胞生物學以及蟲苗研制等提供了轉染系統。

附圖說明

附圖1為以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉染系統示意圖；

附圖2為基于病毒的綠色熒光蛋白在球蟲體內表達效果。

具體實施方法：

實施例1

以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉染系統

如附圖1所示,根據柔嫩艾美爾球蟲病毒（EtRV1）基因組dsRNA的序列特征，將綠色熒光蛋白（enhanced?green?fluorescent?protein，EGFP）基因替換dsRNA部分編碼區，構建EtRV1與?GFP的嵌合體。柔嫩艾美爾球蟲病毒的核酸序列，如SEQ?ID?NO:1所示。對EtRV1?dsRNA運用PCR反應將T7啟動子引入到dsRNA?cDNA的5′端前，運用PCR方法擴增出EtRV1的5′端377bp?（包括5′端UTRs）、3′端141bp，EGFP編碼區717bp三個片段，構建EtRV1與EGFP的嵌合體，并分別克隆入載體pMD-18T，得重組質粒pMD-18T-5’UTR-EGFP-3’UTR，經EcoRI與HindII?酶切線性化后，用凝膠回收試劑盒回收、定量。取約2μg?線性化質粒作為模板，應用T7?RiboMAXTM?Express?Large?Scale?RNA?Production?System?進行體外轉錄。將線性化質粒pMD-18T-5’UTR-EGFP-3’UTR體外轉錄體RNA（200μg）加入柔嫩艾美爾球蟲未孢子化卵囊Cytomix溶液中，溶液終體積為100μl，使用Bio-Rad?1mm電轉杯，以電壓500V、脈沖時間0.3ms間隔100ms連續進行三次電擊反應。之后冰浴20min，離心沉淀后，加500ul滅菌水，轉移至24孔細胞培養板中，于28.5℃溫箱中作用12h。在藍熒光激發條件下，球蟲卵囊發出綠色熒光（見附圖2；A、紫外光可見光下觀察。B、可見光下觀察）。說明可以利用柔嫩艾美爾球蟲病毒作為一種轉染載體，攜帶外源基因在其體內表達。

SEQ?ID?NO:1?

<110>?吉林大學

<120>

<140>

<160>?1

<210>?1

<211>?6006

<212>?DNA