[發(fā)明專利]一種診斷用微小隱孢子蟲重組抗原

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410011922.2
• 申請日: 2014-01-12
• 公開（公告）號: CN103740733A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設計）人: 尹繼剛;高依然;向梅;姜寧;陸慧君;陳啟軍
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/30
• 分類號: C12N15/30;C07K14/44;G01N33/569
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術領域

????本發(fā)明屬生物學診斷技術領域，確切地說是一種診斷用微小隱孢子蟲重組抗原及以該抗原為診斷抗原檢測抗微小隱孢子蟲?IgG抗體的試劑盒。

背景技術

隱孢子蟲屬頂復門原蟲。從致病性方面分類該蟲屬于機會性原蟲。蟲體主要寄生于胃腸道上皮細胞的微絨毛邊緣，感染宿主后癥狀表現(xiàn)輕重不一。隱孢子蟲是公認的引起發(fā)展中國家兒童腹瀉的重要原因之一也是艾滋病患者，免疫力低下者主要的致死原因。目前為止隱孢子蟲分為24種，其中感染人的主要蟲種為微小隱孢子蟲（C．parvum）和人隱孢子蟲（C.?hominis）。美國將微小隱孢子蟲列為B類生物武器。本病缺乏明顯的臨床特征，在癥狀和體征上與其他病原體引起的腸炎相比無明顯區(qū)別。目前隱孢子蟲的檢測方法主要包括病原學檢測、免疫學檢測和分子生物學方法。但是，病原學檢測費時、費力，鏡檢的敏感性差、干擾多。分子生物學方法對儀器要求較高，不宜普及。免疫學檢測具有較高的特異性與敏感性適用于臨床診斷與流行病學調(diào)查。

但是目前國內(nèi)外的研究的重組抗原主要集中在表面抗原?CP23、CP41、SA35?與SA40等。隱孢子蟲很多蟲種的基因組信息已經(jīng)公布，這將為更多抗原，特別是診斷等抗原分子的研究提供重要基礎。

國內(nèi)尚無標準化的重組抗原診斷試劑盒，所以急需尋找新的敏感、特異的重組抗原，對隱孢子蟲病流行病學調(diào)查和防治研究具有重要意義。因此本實驗旨在篩選可替代天然抗原的重組抗原，用于隱孢子蟲病的免疫學診斷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為提高隱孢子蟲病的免疫學診斷敏感性和特異性，而提供一種微小隱孢子蟲重組抗原基因、重組抗原蛋白及用于隱孢子蟲病的免疫學診斷試劑盒。

一種微小隱孢子蟲重組抗原基因MUCIN，它的堿基序列如序列表SEQ?ID?No.1所示。

一種微小隱孢子蟲重組抗原rMUCIN，它是由堿基序列如序列表SEQ?ID?No.1所示基因表達的蛋白。

ELISA檢測抗微小隱孢子蟲?IgG抗體的試劑盒，它的檢測抗原是由堿基序列如序列表SEQ?ID?No.1所示基因表達的蛋白；

所述的ELISA檢測抗微小隱孢子蟲?IgG抗體的試劑盒，陽性對照為微小隱孢子蟲rCp23抗原。

本發(fā)明提供了一種微小隱孢子蟲重組抗原基因MUCIN，及其表達的融合蛋白重組抗原rMUCIN，隨機取的520份健康人血清，用重組抗原rMUCIN和rCp23做檢測抗原，ELISA檢測人血清IgG抗體，用spss軟件對數(shù)據(jù)進行分析rMUCIN蛋白質(zhì)與rCP23蛋白質(zhì)檢測未知血清陽性率相同（X_C²=0.370??P=0.543＞0.05），而rMUCIN蛋白質(zhì)檢測未知血清陽性率高于微小隱孢子蟲粗抗原（X_C²=5..222??P=0.02＜0.05）。本發(fā)明還提供了ELISA檢測抗微小隱孢子蟲?IgG抗體的試劑盒，它是以重組抗原rMUCIN做檢測抗原，以rCp23做陽性對照，特異性、敏感性和可靠性更強。

附圖說明

????圖1?MUCIN基因1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的產(chǎn)物圖；??M?:Marker；1:MUCIN基因的PCR擴增；

圖2?克隆載體酶切鑒定結果?；M?:Marker；1:重組質(zhì)粒?PMD18-T-?MUCIN雙酶切；

圖3重組表達載體的酶切鑒定結果；?M?:Marker；1:重組質(zhì)粒pET-28a-MUCIN雙酶切；

圖4?、5純化的目的蛋白鑒定結果；?M?:蛋白質(zhì)分子量標準；1:重組蛋白質(zhì)rMUCIN；

圖6?重組抗原MUCIN和CP23抗微小隱孢子蟲?IgG抗體反應吸光度值的線性回歸；實線表示最佳擬合線；

圖7??Western?blot檢測陽性血清樣本，M:?蛋白質(zhì)分子量標準；1-15：重組抗原MUCIN?Western?blot檢測部分陽性血清樣本；NC：陰性對照。

具體實施方式

????實施例1微小隱孢子蟲抗原基因的MUCIN的克隆

一、提取微小隱孢子蟲C．parvum?(長春分離株)總DNA?

（1）1×10⁷個微小隱孢子蟲加入1ml裂解液((0.5%?SDS?,1mM?EDTA?,?50mM?Tris-HCl?（pH?8.5）)懸浮沉淀兩次，每次14000×g，5min，棄掉上清；