[發(fā)明專利]檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種的TaqMan探針實時熒光引物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410011304.8
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103789418A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊雷亮;孫麗霞;邱德義;陳定虎;李華平;管維;王章根
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國中山出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 北京金智普華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 巴曉艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速鑒定與定量檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種的TaqMan探針實時熒光引物及其檢測方法。?

背景技術(shù)

由尖孢鐮刀菌1號（Fusarium?oxysporum?f.sp.cubense?race1，F(xiàn)OC1）和4號生理小種（F.oxysporum?f.sp.cubense?race4，F(xiàn)OC4）引起的香蕉鐮刀菌枯萎病，是世界上香蕉的毀滅性病害，給世界的香蕉產(chǎn)業(yè)帶來巨大的危害。香蕉主要集中于非洲、南美洲和亞洲，年產(chǎn)量近一億噸，是世界第二大水果作物，同時為近5億人口的主要糧食之一，是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物。日前共有120個國家和地區(qū)生產(chǎn)香蕉。近年來我國香蕉生產(chǎn)發(fā)展迅猛，居全球第二。香蕉業(yè)己成為我國熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。但是，隨著香蕉種植面積逐年增加，香蕉病害的危害也日益嚴(yán)重，尤其是香蕉枯萎病給香蕉生產(chǎn)帶來極大的威脅。1876年，Joseph?Bancroft在澳大利亞首次報道了香蕉枯萎病。1904年在美國夏威夷也發(fā)現(xiàn)此病，1910年，巴拿馬因香蕉枯萎病大發(fā)生，造成慘重?fù)p失，因而香蕉枯萎病又稱為香蕉巴拿馬病。同年，由Erwin?F.Smith在古巴從香蕉病組織中分離到該病的病原菌，并將其命名為Fusarium?oxysporum?f.cubense?E.F.Smith。1913年Ashby對該病害及其病原菌首次做了詳細(xì)的描述，Brandes于1919年首次確證了該病菌的致病性，1940年由Snyder和Hansen建議將該病菌正式命名為F.oxysporum?Schlecht.f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder?et?Hansen。目前，該病害已廣泛分布于亞洲、非洲、澳大利亞、南太平洋及熱帶美洲的香蕉產(chǎn)區(qū)。該病（1號小種）于1940—1950在中南美洲國家爆發(fā)感染，使風(fēng)糜世界的國際貿(mào)易香蕉品種大蜜哈（Gros?Michel）退出歷史舞臺。1967年我國臺灣省發(fā)生香蕉枯萎病,20世紀(jì)70年代后流行,使臺灣的香蕉面積從最高峰時期的50000公頃降至近年的5000公頃,而且其中的一半仍受到枯萎病的影響。菲律賓、澳大利亞、馬來西亞、非洲等國家和地區(qū)的香蕉也相繼局部發(fā)生枯萎病。?

在中國于十九世紀(jì)五六十年代在廣東、廣西、海南發(fā)現(xiàn)該病侵染為害粉蕉，1996年廣東番禺萬頃沙鎮(zhèn)的巴西及廣東2號香蕉出現(xiàn)枯萎病，現(xiàn)已通過種苗和流水等傳染途徑擴(kuò)散至中山、珠海、東莞、肇慶、信宜、高州和湛江（雷州半島）等地，該病每年以30—50公里速度傳播，使許多蕉園不能種植香蕉，目前已有1000多公頃蕉園棄耕。現(xiàn)廣東、廣西（如?南寧、百色）、福建（如漳州）、海南（如文昌、萬寧、儋州、安定、澄邁）、云南（如河口、景洪）和臺灣均有分布，對我國香蕉種植業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。?

該菌因生理小種不同而危害不同品種的香蕉，世界上已報道有3個生理小種，其中1號小種世界性分布，感染粉蕉、香蕉的栽培品種大蜜哈(AAA)和Apple(AAB)、Silk(AAB)、Taiwan?Latundan(AAB)和IC2(AAAA)等香蕉品系；2號小種在中美洲洪都拉斯、薩爾瓦多、波多黎哥、多米尼加和維爾京群島分布，僅感染雜種三倍體Bluggoe(ABB)及其近緣品種和某些Jamaica四倍體(AAAA)蕉；4號小種主要分布在澳大利亞、非洲以及菲律賓（卡拉雷群島）等部分亞洲國家，可感染大蜜哈(AAA)、Taiwan?Latundan(AAB)、Pisang?Lilin(AA)、野蕉(BB)等所有香蕉和大蕉品種及對其他小種有抗性的香牙蕉（AAA），故危險性和毀滅性最大，引起世界各香蕉種植國家的高度關(guān)注。目前中國以小種4號和1號危害最為嚴(yán)重。?

目前該病害沒有好的防治措施，而且危害的區(qū)域在不斷擴(kuò)大，且對于粉蕉更存在FOC1侵染的現(xiàn)象。粉蕉經(jīng)濟(jì)價值高，且隨著種植面積的增大，病害發(fā)生也日趨嚴(yán)重，對于粉蕉苗的檢測和發(fā)病初期的早期檢測而言，需要更為靈敏和準(zhǔn)確有效的檢測方法。對香蕉枯萎病及其病原的檢測鑒定和監(jiān)控防疫工作是解決香蕉枯萎病問題的前提和基礎(chǔ)，檢測方法的建立和應(yīng)用對于阻止病害蔓延和發(fā)生具有重要的意義。?

國內(nèi)的檢測鑒定研究，如王國芬等根據(jù)香蕉枯萎病菌ITS序列設(shè)計合成的三條引物:FusF1(5′AACCCCTGTGAACATACCACTTG3′)、FusR1(5′GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3′)和FusR2(5′GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3′)構(gòu)成引物對A(FusF1/R1)和B(FusF1/R2),對尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌進(jìn)行了有效的PCR特異擴(kuò)增試驗。?