[發明專利]檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的TaqMan探針實時熒光引物及其應用

有效

• 申請號: 201410011302.9
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103789417A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 楊雷亮;孫麗霞;邱德義;陳定虎;李華平;管維;王章根
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國中山出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 巴曉艷

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種快速鑒定與定量檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的TaqMan探針實時熒光引物及其檢測方法。

背景技術

由尖孢鐮刀菌1號（Fusarium?oxysporum?f.sp.cubense?race1，FOC1）和4號生理小種（F.oxysporum?f.sp.cubense?race4，FOC4）引起的香蕉鐮刀菌枯萎病，是世界上香蕉的毀滅性病害，給世界的香蕉產業帶來巨大的危害。香蕉主要集中于非洲、南美洲和亞洲，年產量近一億噸，是世界第二大水果作物，同時為近5億人口的主要糧食之一，是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物。日前共有120個國家和地區生產香蕉。近年來我國香蕉生產發展迅猛，居全球第二。香蕉業己成為我國熱帶地區農業的支柱產業。但是，隨著香蕉種植面積逐年增加，香蕉病害的危害也日益嚴重，尤其是香蕉枯萎病給香蕉生產帶來極大的威脅。1876年，Joseph?Bancroft在澳大利亞首次報道了香蕉枯萎病。1904年在美國夏威夷也發現此病，1910年，巴拿馬因香蕉枯萎病大發生，造成慘重損失，因而香蕉枯萎病又稱為香蕉巴拿馬病。同年，由Erwin?F.Smith在古巴從香蕉病組織中分離到該病的病原菌，并將其命名為Fusarium?oxysporum?f.cubenseE.F.Smith。1913年Ashby對該病害及其病原菌首次做了詳細的描述，Brandes于1919年首次確證了該病菌的致病性，1940年由Snyder和Hansen建議將該病菌正式命名為F.oxysporum?Schlecht.f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder?et?Hansen。{Moore,1999#67}

目前，該病害已廣泛分布于亞洲、非洲、澳大利亞、南太平洋及熱帶美洲的香蕉產區。該病（1號小種）于1940—1950在中南美洲國家爆發感染，使風糜世界的國際貿易香蕉品種大蜜哈（Gros?Michel）退出歷史舞臺。1967年我國臺灣省發生香蕉枯萎病,20世紀70年代后流行,使臺灣的香蕉面積從最高峰時期的50000公頃降至近年的5000公頃,而且其中的一半仍受到枯萎病的影響。菲律賓、澳大利亞、馬來西亞、非洲等國家和地區的香蕉也相繼局部發生枯萎病。

在中國于十九世紀五六十年代在廣東、廣西、海南發現該病侵染為害粉蕉，1996年廣東番禺萬頃沙鎮的巴西及廣東2號香蕉出現枯萎病，現已通過種苗和流水等傳染途徑擴散至中山、珠海、東莞、肇慶、信宜、高州和湛江（雷州半島）等地，該病每年以30—50公里速度傳播，使許多蕉園不能種植香蕉，目前已有1000多公頃蕉園棄耕。現廣東、廣西（如南寧、百色）、福建（如漳州）、海南（如文昌、萬寧、儋州、安定、澄邁）、云南（如河口、景洪）和臺灣均有分布，對我國香蕉種植業構成嚴重威脅。

該菌因生理小種不同而危害不同品種的香蕉，世界上已報道有3個生理小種，其中1號小種世界性分布，感染粉蕉、香蕉的栽培品種大蜜哈(AAA)和Apple(AAB)、Silk(AAB)、Taiwan?Latundan(AAB)和IC2(AAAA)等香蕉品系；2號小種在中美洲洪都拉斯、薩爾瓦多、波多黎哥、多米尼加和維爾京群島分布，僅感染雜種三倍體Bluggoe(ABB)及其近緣品種和某些Jamaica四倍體(AAAA)蕉；4號小種主要分布在澳大利亞、非洲以及菲律賓（卡拉雷群島）等部分亞洲國家，可感染大蜜哈(AAA)、TaiwanLatundan(AAB)、Pisang?Lilin(AA)、野蕉(BB)等所有香蕉和大蕉品種及對其他小種有抗性的香牙蕉（AAA），故危險性和毀滅性最大，引起世界各香蕉種植國家的高度關注。目前中國以小種4號和1號危害最為嚴重。

目前該病害沒有好的防治措施，而且危害的區域在不斷擴大，且對于粉蕉更存在復合侵染的現象。粉蕉經濟價值高，且隨著種植面積的增大，病害發生也日趨嚴重，對于粉蕉苗的檢測和發病初期的早期檢測而言，需要更為靈敏和準確有效的檢測方法。對香蕉枯萎病及其病原的檢測鑒定和監控防疫工作是解決香蕉枯萎病問題的前提和基礎，檢測方法的建立和應用對于阻止病害蔓延和發生具有重要的意義。

國內的檢測鑒定研究，如王國芬等根據香蕉枯萎病菌ITS序列設計合成的三條引物:FusF1(5′AACCCCTGTGAACATACCACTTG3′)、FusR1(5′GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3′)和FusR2(5′GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3′)構成引物對A(FusF1/R1)和B(FusF1/R2),對尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌進行了有效的PCR特異擴增試驗。