[發(fā)明專利]一種基于親水固相萃取技術(shù)的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物類分離純化方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410010818.1
• 申請(qǐng)日: 2014-01-09
• 公開（公告）號(hào): CN104774235A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁鑫淼;李曉龍;劉艷芳;張?jiān)?/a>;張秀莉;肖遠(yuǎn)勝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C07J41/00
• 分類號(hào): C07J41/00;C07J71/00;C07J19/00
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物選擇性分離的純化方法，其特征在于：

1）蟾蜍皮乙醇提取物先經(jīng)制備型RPLC分離，水（A）和甲醇（B）流動(dòng)相體系；洗脫梯度為體積濃度25%→100%B（v/v）；按各色譜峰的保留時(shí)間分別收集各餾分，每個(gè)組分濃縮至干后備用；

2）針對(duì)富含蟾蜍二烯內(nèi)酯的組分F14，分離過(guò)程中F14組分對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相中甲醇的體積濃度為58.3%-59.6%；采用Click?XIon親水固相萃取柱對(duì)兩類化合物進(jìn)行類分離，固相萃取條件：親水固相萃取柱為兩性離子固相萃取柱（Click?XIon，20g/60mL）；淋洗條件為：淋洗1：95%（v/v）乙腈-水或乙醇-水80mL，回收溶劑得F14-F1；淋洗2：50%（v/v）乙腈-甲酸水或乙醇-甲酸水80mL，（酸水體積濃度為0.1%-0.5%）回收溶劑得F14-F2；

3）針對(duì)F14-F1和F14-F2，采用半制備反相色譜進(jìn)行進(jìn)純化制備，色譜柱為XCharge?C18柱；采用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液流動(dòng)相體系，對(duì)蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物進(jìn)行選擇性地分離。

2.按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：固相萃取柱為含兩性離子的親水固相萃取柱（Click?XIon），采用臺(tái)階等度洗脫方式，對(duì)氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物進(jìn)行類分離。

3.按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯類分離方法，其特征在于：固相萃取操作參數(shù)如下：色譜柱內(nèi)徑為10-1000mm；采用體積濃度85%-100%乙醇-水溶解或體積濃度90%-100%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上樣濃度為1mg/mL^-1-1g/mL；上樣量為1mL-400mL；流速為5-1000mL/min。

4.按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：色譜操作參數(shù)如下：色譜柱內(nèi)徑為4.6-100mm；采用體積濃度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上樣濃度為1mg/mL^-1-1g/mL；進(jìn)樣量為1μL-40mL；流速為1-480mL/min；柱溫為10-60℃。

5.按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯固相萃取類分離方法，其特征在于：所述洗脫溶劑流動(dòng)相組成為乙腈-水或乙醇-水體系。

6.按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：所述流動(dòng)相組成為乙腈-水、甲醇-水、乙醇-水。

7.按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物為50%-95%（V/V）乙醇回流提取物。

8.按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：

1）蟾蜍皮50%-95%（V/V）乙醇提取物先經(jīng)制備型RPLC分離，色譜條件：色譜柱為碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流動(dòng)相體系；洗脫梯度為0-7min,體積濃度25%→40%B;7-60min,體積濃度40%→65%B;60-65min,體積濃度65%→100%B;65-75min,100%B；流速為330mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm；其采用體積濃度65%甲醇-水溶解，樣品溶液濃度為440mg/mL，其采用體積濃度65%甲醇-水溶解；進(jìn)樣體積為40mL；按各色譜峰的保留時(shí)間分別收集各餾分，共計(jì)22個(gè)組分，每個(gè)組分濃縮至干后備用；針對(duì)組分F14(分離過(guò)程中F14組分對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相中甲醇的體積濃度為58.3%-59.6%)，采用含兩性離子的Click?XIon親水固相萃取柱臺(tái)階等度洗脫方式實(shí)現(xiàn)了蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的類分離，通過(guò)半制備反相色譜進(jìn)行進(jìn)純化制備，色譜柱為XCharge?C18柱；采用乙腈-水流動(dòng)相體系，采用線性梯度洗脫方式制備蟾蜍二烯內(nèi)酯單體化合物；

2）選取組分F14采用Click?XIon親水固相萃取柱對(duì)兩類化合物進(jìn)行類分離，固相萃取條件：親水固相萃取柱為兩性離子固相萃取柱（Click?XIon，20g/60mL）；淋洗條件為：淋洗1：95%（V/V）乙腈-水或95%（V/V）乙醇-水80mL，回收溶劑得F14-F1;淋洗2：50%（v/v）乙腈-甲酸水或乙醇-甲酸水（酸水體積濃度為0.1%-0.5%）80mL，回收溶劑得F14-F2；

3）選取組分F14-F1和F14-F2,采用半制備反相色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離，色譜條件：色譜柱為半制備反相色譜柱（XCharge?C18,250×20mm,i.d.,5μm）；水（A）和乙腈（B）流動(dòng)相體系；流速為19mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm；進(jìn)樣次數(shù)：3；進(jìn)樣量為2mL；按各色譜峰的保留時(shí)間分別收集各餾分，分別回收溶劑，經(jīng)核磁實(shí)驗(yàn)確定，獲得1-7七個(gè)化合物；

通過(guò)反相色譜制備獲得兩類八個(gè)高純度蟾蜍二烯內(nèi)酯化合物；所述兩類化合物分別為兩個(gè)氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物：化合物1為沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合物2為遠(yuǎn)華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯，五個(gè)非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯：化合物3為遠(yuǎn)華蟾毒精，化合物4為乙酰華蟾毒精,化合物5為乙酰華蟾毒精，化合物6為蟾蜍它靈，化合物7為蟾蜍靈。