[發明專利]樹脂吸附原位分離并耦合發酵生產靈菌紅素的方法

無效

• 申請號: 201410010765.3
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103757069A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 劉曉俠;孫詩清;王玉潔;尤忠毓
• 申請（專利權）人: 嘉興學院
• 主分類號: C12P17/16
• 分類號: C12P17/16
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于生物化學技術領域，尤其涉及一種樹脂吸附原位分離并耦合發酵生產靈菌紅素的方法。

背景技術

如今市場上對靈菌紅素的研究需求很大，其作為天然生物中提取的脂多糖對抗癌及腫瘤有較好的效果。而且目前國內市場大多為從植物中提取的紅色素，相比細菌生產，植物提取周期長，工藝復雜，會對紅色素的質量以及產量造成影響。同時實驗室的沙雷氏菌雖然有著較高的產量。但分離得到純品須通過樹脂層析分離，雖然效果較好，但耗時久，不利于規模化工業化生產。

所以從常見的工業發酵分離耦合方法如吸附法分離中尋求快速分離的方法是一條較好地解決方法。因此，對于靈菌紅素的分離方法需要進行不斷的創新，找到最優的分離耦合路線也非常必要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種樹脂吸附原位分離并耦合發酵生產靈菌紅素的方法，旨在為靈菌紅素的發酵分離耦合提供依據。

本發明是這樣實現的，一種樹脂吸附原位分離并耦合發酵生產靈菌紅素的方法包括以下步驟：

步驟一、采用二級發酵進行靈菌紅素的發酵培養：首先進行平板活化，其次進行種子培養，最后擴大培養；

步驟二、針對上樣量、吸附液pH、吸附時間、吸附溫度進行單因素試驗，并測定吸附率；

步驟三、根據單因素試驗確定的正交試驗的試驗因素進行正交試驗。

進一步，所述的樹脂吸附原位分離并耦合發酵生產靈菌紅素的方法的實驗儀器包括：722s可見分光光度計、電子天平AL204、高速離心VS-15000N、HD-930組合式全溫度震蕩培養箱、pH計UB-7。

所述的樹脂吸附原位分離并耦合發酵生產靈菌紅素的方法的試驗試劑包括：D101大孔吸附樹脂，鹽酸，丙酮分析純，蛋白胨、甘油、NaCl、MgSO4、甘氨酸等。

進一步，步驟一所述的采用二級發酵進行靈菌紅素的發酵培養的具體步驟如下：

首先平板活化：將在零下70度保藏的菌種在準備好的平板上劃線，37℃培養12小時；

其次種子培養：挑選平板上的長勢好的單菌落接入搖瓶中培養，37℃，200r/min，12小時；

最后擴大培養：將種子培養液接入準配好的搖瓶中，28℃，200r/min，48小時。

進一步，步驟二所述的吸附率測定的具體方法如下:

將實驗所得靈菌紅素丙酮提取液旋轉蒸發至恒重，準確稱取產品0.0400g，然后用丙酮定容至50ml容量瓶中，制成0.8g/L儲備液，用移液槍準確吸取150ul，200ul，250ul，300ul，350ul儲備液于10ml容量瓶中，以丙酮定容，制成0.012g/L，0.016g/L，0.020g/L，0.024g/L，0.028g/L溶液，在535nm下,測其OD值，以OD值為橫坐標，產品濃度為縱坐標繪制曲線；

D101對靈菌紅素的吸附公式為（1）

O為吸附率（g/g），C1為靈菌紅素在發酵液中的含量（g/L），C2為靈菌紅素在吸附后發酵液中的含量（g/L），M為放入發酵液中的D101質量（g），V為發酵液體積（L）。

進一步，步驟二所述的單因素試驗的具體方法如下：

針對上樣量的試驗：準確稱取以乙醇活化過的D101大孔吸附樹脂0.5g左右六份，分別放入發酵液體積為10，20,30,40,50,60ml搖瓶，放入28℃，200r/min的恒溫搖床中震蕩約20小時，之后與未吸附的發酵液一并稀釋100倍測取OD值，按照公式（1）測吸附率。

針對pH的試驗：準確稱取以乙醇活化過的D101大孔吸附樹脂0.5g左右六份，分別放入含有10ml發酵液pH分別為1,2,3,4,5,6,7的搖瓶中，放入28℃，200r/min的恒溫搖床中震蕩約20小時，之后與未吸附的發酵液一并稀釋100倍測取OD值，按照公式（1）測吸附率。

針對吸附時間的試驗：準確稱取以乙醇活化過的D101大孔吸附樹脂0.5g左右六份，分別放入含有10ml發酵液的搖瓶中，放入28℃，200r/min的恒溫搖床中震蕩，分別在震蕩1,5,10,15,20,25h后稀釋100倍測取OD值，未吸附的發酵液一并稀釋100倍測取OD值，按照公式（1）測吸附率。

針對吸附溫度的試驗：準確稱取以乙醇活化過的D101大孔吸附樹脂0.5g左右五份，分別放入含有10ml發酵液的搖瓶在15,20,25,30,35℃，搖床中震蕩20h后稀釋100倍測取OD值，未吸附的發酵液一并稀釋100倍測取OD值，按照公式（1）測吸附率。