[發明專利]一種靈菌紅素的提取分離方法

有效

• 申請號: 201410010725.9
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103755619A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 劉曉俠;孫詩清;王玉潔;尤忠毓
• 申請（專利權）人: 嘉興學院
• 主分類號: C07D207/44
• 分類號: C07D207/44;C07G99/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于生物化學技術領域，尤其涉及一種靈菌紅素的提取分離方法。

背景技術

靈菌紅素是一種主要由微生物產的天然紅色素，1929年Amako等在研究沙雷氏菌（Serratia）生長時發現，而首先分離得到靈菌紅素的是Harashima等在1960年完成的。隨著研究人員對靈菌紅素的性質及生物活性的不對深入研究，發現它具有抗細菌、抗瘧疾、抗真菌、抗原生動物，以及人們最關注的免疫抑制活性和引起腫瘤細胞凋亡的作用,因此作為一種天然色素，靈菌紅素在醫學、食品、印染、紡織、飼料添加劑、環境治理等領域，均有巨大的應用潛力和廣闊的市場前景。且靈菌紅素作為一種微生物所產的色素，克服了植物色素提取的諸多弊端，如生產周期短，同時不受資源、時間和空間等因素的限制，并且易于工業化生產。因此，靈菌紅素的前景極其廣泛。

微生物產天然色素有多方面的優點，但縱使有千萬種優點，不能分離得到目的產品也是枉然，所以本實驗旨在得到一種合適的分離靈菌紅素的方法。微生物的次級代謝產物分離純化的目的是從發酵液中分離得到高純度，能符合食品藥品等質量要求的產品，但由于發酵液中成分多且雜，故分離純化的成本往往較高，占產品總成本的比例很大，不同的產品，分離純化的成本約占40-70%之間。所以研究合理的下游工程技術及計算該技術所需的成本價格，對靈菌紅素商品化生產的經濟效益具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種靈菌紅素的提取分離方法，旨在得到一種合適的分離靈菌紅素的方法，降低分離純化成本。

本發明是這樣實現的，一種靈菌紅素的提取分離方法包括以下步驟：

步驟一、選取實驗室優化的菌種，經斜面活化后接入種子培養基，進行發酵培養；

步驟二、提取靈菌紅素：取發酵液，離心，加入適量酸性丙酮，超聲提取，用旋轉蒸發器旋轉蒸干得到丙酮粗提物，用石油醚進行脫酯；

步驟三、利用薄層層析的方法來進行硅膠柱層析前的預實驗，通過改變配比進行多次試驗，得到最好的溶劑配比；

步驟四、進行柱層析；

步驟五、進行二次柱層析分離純化。

進一步，步驟一所述的發酵培養的具體方法為：

選取實驗室優化的菌種，經斜面活化后接入種子培養基，37℃，180r/min的搖床培養12h；種子培養基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl5.0g/L，瓊脂18.0g/L，pH：7.4～7.6；

隨后發酵培養，250mL三角瓶，裝液量50mL，按5%的接種量接種至發酵培養基中，37℃，180r/min的搖床培養48h；發酵培養基：甘油20.0g/L，蛋白胨13.0g/L，MgSO₄1.2g/L，NaCl5.0g/L，搖瓶裝液量20mL/100mL，接種量5%V/V，pH：6.5。

進一步，步驟二所述的提取靈菌紅素的具體方法為：

取發酵液，10000rmp下離心10min，加入適量pH=3.0的酸性丙酮，25℃下，超聲提取20min，提取三次至菌體無色，隨后用旋轉蒸發器60℃旋轉蒸干得到丙酮粗提物，回收丙酮還能重復利用，由于之前用丙酮粗提物上柱得到的靈菌紅素干燥后成油脂狀，無法干燥，所以用石油醚進行脫酯，重復三次，稱量。

進一步，步驟三所述的預實驗，在氯仿-乙酸乙酯的溶劑系統上加入甲醇來加大極性，采用氯仿-乙酸乙酯-甲醇的溶劑系統。

進一步，步驟四所述的柱層析的具體方法如下：

裝柱:一般柱層析中吸附劑的填充量應占柱子體積的1/4-1/5，采取濕法上柱，操作如下：

（1）將稱量的硅膠加入燒杯中，倒入選定極性的洗脫劑，使硅膠完全浸入溶液中；

（2）用超聲波清洗機，邊超聲震蕩邊用玻璃棒攪拌，打散硅膠團，趕出氣泡；

（3）預先往硅膠柱中加少量溶劑，然后在攪拌下緩緩將硅膠倒入柱中；

（4）靜置直至硅膠層不再降低，排除多余溶劑，計算主留體積；

（5）在硅膠上墊一層濾紙，防止加溶劑時將上層硅膠沖起；

（6）測量高徑比；

加樣:在超聲震蕩下用少量洗脫劑溶解樣品，用滴管將樣液緩緩沿壁均勻加入到柱體上面，最后用少量溶劑對主壁清洗2-3次；

洗脫:用找到的最優洗脫劑溶劑洗脫，在洗脫過程中，不能使層面擾動，尤其是開始階段，洗脫速度控制在每分鐘流出為柱體積1/200左右，對于不同顏色的條帶分開接收，接收用的玻璃儀器必須干凈、干燥，當用第一種洗脫劑無法洗脫下物質時，用之后確定的加大極性后的展開劑進行洗脫；