[發明專利]重組梅花鹿鹿茸胸腺素β4及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201410010357.8
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103739699A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 趙雨;冷向陽;張惠;李銀清;張巍;惠歌;李曉華
• 申請（專利權）人: 趙雨;冷向陽
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C12N15/16;C12N15/70;A61K38/22;A61P19/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種重組梅花鹿鹿茸胸腺素β4及其制備方法和用途。

背景技術

胸腺素（Thymosins）是由胸腺產生的一種淋巴生長因子，1966年Goldstein等首次從小牛胸腺中提取發現，是一類小分子多肽。根據等電點的不同胸腺素可分為α、β、γ三個亞型，其中β族胸腺素其結構高度保守，含有40～44個氨基酸，廣泛存在于哺乳動物和其它脊椎動物中。而在大多數哺乳動物中，胸腺素β₄是β族胸腺素的主要存在形式，可占其總含量的70%～80%。近年來，胸腺素β₄的生物學功能倍受人們關注，已有研究表明，胸腺素β₄在促進創傷愈合、組織再生、角膜損傷修復、心肌修復、血管生成、抗細胞凋亡和抗炎等方面起著重要作用?？梢哉f胸腺素β₄具有非常廣泛的應用領域。而現階段，臨床應用的胸腺素β₄絕大部分為化學合成產品，不僅原料價格高、工藝復雜、收率較低，而且合成過程中用到很多有毒物質，對環境污染較大。隨著現代生物技術的發展，利用基因工程手段生產胸腺素β₄將成為一個新的途徑。

梅花鹿鹿茸作為我國傳統名貴動物藥，具有極高的藥用價值，已有2000多年的入藥歷史。鹿茸與其他哺乳動物的角有著明顯的區別，每年都可以循環再生，且具有無可比擬的生長速度，最快時每天可達2cm。其獨特的生長過程令許多生物學家對其癡迷，并將其視為理想的研究組織器官再生的生物模型。目前，尚未見制備梅花鹿鹿茸胸腺素β4的相關報道。

發明內容

本發明提供一種重組梅花鹿鹿茸胸腺素β₄及其制備方法和用途。

一種重組梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所述。

一種重組梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所述。

所述的重組梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的制備方法，包括如下步驟：

（1）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄基因的克?。翰捎酶牧嫉腡rizol法提取鹿茸總RNA。設計及合成梅花鹿鹿茸胸腺素β₄特異引物，上游引物為5′—CATGCCATGGCCTCTGACAAGCCCGATAT—3′，下游引物為5′—CCCTCGAGCGACTCGCCTGCTTGCT—3′，通過RT-PCR方法擴增得到胸腺素β4基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所述，全長為135bp，與載體pMD18-T連接，獲得重組載體pMD18-T-Tβ₄，將其轉化至E.coli?DH5α感受態細胞中，用EcoR?I和Sal?I雙酶切鑒定并進行測序驗證；

（2）梅花鹿鹿茸胸腺素β4原核表達載體的構建：用Ncol?I和Xhol?I將測序正確的重組載體pMD18-T-Tβ₄和表達載體pET-28a分別進行雙酶切，連接后轉化至E.coli?BL21感受態細胞中，雙酶切鑒定并進行測序驗證；

（3）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的表達和純化：將構建成功的表達載體pET-28a-Tβ₄轉化到宿主菌E.coli?BL21中，用IPTG誘導表達，采用鎳離子親和層析進行分離純化，并用Sephadex?G-25凝膠層析除鹽，收集除鹽后的樣品，冷凍干燥即得。

所述的IPTG誘導表達，IPTG誘導濃度為0.5mmol/L，誘導時間為4h。

所述的鎳離子親和層析分離純化時，結合液為含有500mmol/L?NaCl的磷酸鹽緩沖液，pH7.4，洗脫液為含有500mmol/L?NaCl、200mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液，pH7.4。

所述的重組梅花鹿鹿茸胸腺素β₄在制備對成骨細胞M3T3或軟骨細胞C5.18具有促增殖作用的藥物中的應用。

本發明利用基因工程技術首次成功構建了梅花鹿鹿茸胸腺素β₄原核表達載體，并誘導重組蛋白高效表達，純化后的重組蛋白含量可達0.916mg/mL。經體外活性研究發現，其對成骨細胞M3T3和軟骨細胞C5.18有明顯的促增殖作用。獲取梅花鹿鹿茸胸腺素β₄對鹿茸快速生長機制的研究、鹿茸藥材有效成分的研究以及開發高科技含量的鹿茸產品都具有重大意義，且具有廣闊的應用前景。