[發(fā)明專利]基于三維有序金摻雜納米二氧化鈦電極的DNA生物傳感器及其制備和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410009934.1
• 申請日: 2014-01-10
• 公開（公告）號: CN103743802A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 常穎萃;杜江燕
• 申請（專利權(quán)）人: 南京師范大學(xué)
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/26
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 韓朝暉

1.一種基于三維有序金摻雜納米二氧化鈦電極的DNA生物傳感器，其特征在于，所述的生物傳感器包括三維有序多孔結(jié)構(gòu)的金摻雜納米TiO₂修飾的ITO電極，其表面固定DNA探針，所述的DNA探針為5’端標(biāo)記有二茂鐵的DNA探針5’-Fc-GAA?CAA?AAG?GAA?GAA?AATC-(SH)-3’?，標(biāo)記為5’-Fc-ssDNA。

2.一種權(quán)利要求1所述的DNA生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

1）制備三維有序多孔結(jié)構(gòu)的金摻雜納米TiO₂修飾的ITO電極，標(biāo)記為3DOM?GTD/ITO修飾電極；

2）將DNA探針溶液滴于3DOM?GTD/ITO修飾電極表面，所述的DNA探針為5’端二茂鐵標(biāo)記的DNA探針5’-Fc-GAA?CAA?AAG?GAA?GAA?AATC-(SH)-3’，標(biāo)記為5’-Fc-ssDNA；在4?℃下晾干，制得所述的DNA生物傳感器，標(biāo)記為5’-Fc-ssDNA?/3DOM?GTD/ITO修飾電極。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述的3DOM?GTD/ITO修飾電極采用以下方法制備：

1）制備金摻雜納米TiO₂溶膠；

2）將處理好的ITO在1%PS小球乙醇溶液放置，隨著乙醇溶液的揮發(fā)，PS小球通過自組裝到ITO電極表面，形成六方緊密堆積結(jié)構(gòu)，然后將其放置烘箱中于95℃恒溫固化，即得到PS小球模板；

3）將PS小球模板傾斜，移取金摻雜納米TiO₂溶膠沿PS小球模板斜面滴下，直到浸潤整片模板，室溫晾5-10min；再次滴加所述的金摻雜納米TiO₂溶膠，重復(fù)上述過程3次，晾干備用；

4）馬弗爐中高溫煅燒去除模板中的PS小球模板，以2℃/min的速度升溫至500℃，并恒溫2h，然后以2℃/min的速度降至室溫，制得所述的3DOM?GTD/ITO修飾電極。

4.一種基于權(quán)利要求1所述的DNA生物傳感器檢測乳腺癌基因的方法，包括下列步驟：

1）DNA探針在修飾電極上的固定

取40μL?1.0×10^-5mol/L?5’-Fc-ssDNA溶液滴于3DOM?GTD/ITO修飾電極表面，在4?℃下晾干，制得5’-Fc-ssDNA?/3DOM?GTD/ITO修飾電極；

2）雜交反應(yīng)

將步驟1）所述的修飾電極置于包含乳腺癌基因片段ss1的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行雜交，所述的基因片段ss1?DNA序列為5’-GAT?TTT?CTT?CCT?TTT?GTTC-3’，取出電極，用二次蒸餾水清洗，去除非特異性吸附的基因片段ss1，在4?℃下晾干；

3）電化學(xué)檢測

采用三電極系統(tǒng)以示差脈沖伏安方法檢測DNA雜交信號的變化，分別以制備的5’-Fc-ssDNA?/3DOM?GTD/ITO修飾電極和雜交后的該電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對電極，在電解液為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行示差脈沖伏安掃描，根據(jù)峰電流的變化值測定乳腺癌基因片段ss1的濃度。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測乳腺癌基因的方法，其特征在于，步驟3）中測定乳腺癌基因片段ss1的濃度的方法包括以下步驟：

a、ss1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組含不同已知濃度ss1的磷酸鹽緩沖溶液；

b、建立工作曲線：將制備的DNA探針的修飾電極分別浸入不同濃度ss1磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行雜交反應(yīng)，反應(yīng)完成后將電極取出，用二次蒸餾水沖洗，除去未雜交的ss1，在4?℃下晾干；將DNA探針電極及雜交后的該電極在磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行DPV掃描，記錄峰電流的變化；峰電流值I與標(biāo)準(zhǔn)溶液中ss1的濃度c成反比，繪制I-c標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用線性回歸法得到I-c線性回歸方程；

c、乳腺癌基因樣品的檢測：將待測樣品配制成溶液，在磷酸鹽緩沖溶液中按照與步驟b相同的方法進(jìn)行雜交反應(yīng)和示差脈沖伏安掃描，記錄響應(yīng)電流；若雜交后的電極上響應(yīng)電流無明顯變化，表明待測樣品中不含乳腺癌基因片段ss1；若響應(yīng)電流減小，則表明樣品中含乳腺癌基因片段，根據(jù)I-c標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品中ss1的濃度。