[發(fā)明專利]中華鱘boule基因序列及其用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410009215.X
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103710353A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 李創(chuàng)舉;葉歡;危起偉;岳華梅
• 申請（專利權）人: 中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N5/075;C12N5/076;C12Q1/68;C07K14/46
• 代理公司: 荊州市技經(jīng)專利事務所 42219
• 代理人: 韓志剛

技術領域

本發(fā)明涉及到生物工程領域，特別涉及到一種中華鱘boule基因序列及其用途。

背景技術

中華鱘(Acipenser?sinensis)是一種古老的大型溯河產(chǎn)卵洄游性魚類,?具有在淡水中繁殖、海水中生長和發(fā)育的生活習性。由于筑壩、航運、污染和過度捕撈等人類活動的影響，中華鱘資源量急劇下降，1988年被列為國家一級重點保護動物。長江所自上世紀80年代即開始從事中華鱘人工繁殖工作，并實現(xiàn)了規(guī)模化人工繁殖，但此種方法需要對其親本長期養(yǎng)殖，需要投入大量的人力、物力和財力，而且還存在親魚死亡等多種風險，因此，有必要尋求其他辦法對該物種進行多途徑的保護。近年來隨著生物技術的快速發(fā)展，生殖細胞移植被認為是一種周期短而且有效的方法，在多種魚類中有成功應用的報道。該種方法的實施需要首先鑒定出中華鱘生殖細胞的標記基因，在此基礎上再鑒定并分離生殖細胞用于生殖細胞移植。

DAZ基因家族成員均為生殖細胞標記基因，包括3個成員：daz、dazl和boule，其編碼的蛋白質(zhì)都含有一個保守的RRM結構域和一個或多個DAZ結構域。目前的觀點認為，boule是DAZ基因家族的祖先基因。在脊椎動物的進化過程中，boule經(jīng)過復制在常染色體上產(chǎn)生dazl基因；dazl基因再經(jīng)一次復制、轉(zhuǎn)座及多次復制，在Y染色體上產(chǎn)生多個拷貝DNA基因。雖然有研究報道boule基因在線蟲、青鳉和虹鱒的卵巢中有表達，但它主要還是在精巢中表達。果蠅中，boule基因的突變使雄性的生殖細胞停留在減數(shù)分裂期。另外，boule基因在人類睪丸組織(第一次減數(shù)分裂前中期的生殖細胞)中特異表達，是人類精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂轉(zhuǎn)換的主要調(diào)控因子。因此，對中華鱘boule基因研究，了解其在生殖細胞中的表達特征，并應用于生殖細胞的鑒定、追蹤和分離，可為中華鱘生殖細胞移植和種質(zhì)資源保存等方面的應用研究奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種中華鱘boule基因序列及其用途。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為：

本發(fā)明所述的中華鱘boule基因全長cDNA為2586bp，開放閱讀框為1065?bp，編碼354個氨基酸，具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。

本發(fā)明利用熒光定量PCR技術檢測中華鱘boule基因在不同組織（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸、精巢、卵巢、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦）的轉(zhuǎn)錄水平，結果表明：boule基因只在精巢和卵巢中表達，且精巢的表達量是卵巢的18倍左右。

本發(fā)明利用原位雜交技術研究了中華鱘boule基因在精巢和卵巢中表達特征，結果表明：該基因在精巢中的精原細胞和初級精母細胞中有表達，在次級精母細胞中的表達量有所增加，而在精子細胞中幾乎不表達；在卵巢中，中華鱘boule基因在卵原細胞和初級卵母細胞中大量表達。

本發(fā)明制備了中華鱘boule蛋白的特異性多克隆抗體。

本發(fā)明利用Western?Blot技術檢測中華鱘boule蛋白在不同組織（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸、精巢、卵巢、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦）的表達特征，結果表明：boule蛋白只在精巢和卵巢中表達。?

本發(fā)明利用免疫組化技術研究中華鱘boule蛋白在精巢和卵巢中的表達特征，結果表明：在精巢中，boule蛋白在精原細胞、初級精母細胞和次級精母細胞中有表達，而在精子細胞中的表達量減弱，精子中幾乎不見，卵巢中，boule蛋白在卵原細胞和初級卵母細胞中大量表達。

本發(fā)明的積極效果為：本發(fā)明提供了中華鱘boule基因的序列和不同組織中的其RNA和蛋白表達特征，鑒定了一種中華鱘生殖細胞標記基因。該基因可以應用于篩選和分離中華鱘生殖細胞，為中華鱘生殖細胞移植和種質(zhì)資源保存等方面的應用研究奠定基礎。

附圖說明

圖1為Real-time?PCR檢測boule基因在中華鱘不同組織中的表達特征；

圖2為boule基因在中華鱘卵巢和精巢中的表達特征。A和B為卵巢，B為A中矩形區(qū)域的放大；C為精巢；og為卵原細胞，Ⅰ和Ⅱ為初級卵母細胞；SG為精原細胞，PSP為初級精母細胞，SSP為次級精母細胞，SPD為精子細胞；

圖3為boule蛋白在中華鱘不同組織中的表達特征；