[發明專利]中華鱘dazl基因序列及其用途

無效

• 申請號: 201410009214.5
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103725690A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 李創舉;葉歡;危起偉;岳華梅
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/46;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 荊州市技經專利事務所 42219
• 代理人: 韓志剛

技術領域

本發明涉及到生物工程領域，特別涉及到一種中華鱘dazl基因序列及其用途。

背景技術

中華鱘(Acipenser?sinensis)是一種古老的大型溯河產卵洄游性魚類,?具有在淡水中繁殖，海水中生長、發育的生活習性。由于筑壩、航運、污染和過度捕撈等人類活動的影響，中華鱘資源量急劇下降，1988年被列為國家一級重點保護動物。長江水產研究所自上世紀80年代即開始從事中華鱘人工繁殖工作，2012年實現了規模化人工繁殖，但此種方法需要對其親本長期養殖，需要投入大量的人力、物力和財力，而且還存在親魚死亡等多種風險，因此，有必要尋求其他辦法對該物種進行多途徑的保護。近年來隨著生物技術的快速發展，生殖細胞移植被認為是一種周期短而且有效的方法，在多種魚類中有成功應用的報道。該種方法的實施需要首先鑒定出中華鱘生殖細胞的標記基因，在此基礎上再鑒定并分離生殖細胞用于生殖細胞移植。

????DAZ基因家族成員均為生殖細胞標記基因，包括3個成員：daz、dazl和boule，其編碼的蛋白質都含有一個保守的RRM結構域和一個或多個DAZ結構域。dazl在已研究的所有物種的雌雄生殖細胞都有表達，并在生殖細胞的發育周期中持續表達。由爪蟾dazl?mRNA缺失的卵母細胞發育產生的蝌蚪沒有PGC，意味著Xdazl與生殖細胞的發育有關。另外，鼠的雌、雄性Dazl突變純合體均不育，表現為這種突變體沒有精原細胞或卵原細胞。因此，對中華鱘dazl基因研究，了解其在生殖細胞中的表達特征，并應用于生殖細胞的鑒定、追蹤和分離，可為中華鱘生殖細胞移植和種質資源保存等方面的應用研究奠定基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種中華鱘dazl基因序列及其用途。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

本發明所述的中華鱘dazl基因的全長cDNA序列為2362bp，開放閱讀框為675?bp，編碼224個氨基酸，具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

所述基因編碼的蛋白質具有如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。

本發明利用熒光定量PCR技術檢測中華鱘dazl基因在不同組織（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸、精巢、卵巢、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦）的轉錄水平，結果表明：dazl基因只在精巢和卵巢中表達，且卵巢的表達量是精巢的兩倍左右。

本發明利用原位雜交技術研究了中華鱘dazl基因在精巢和卵巢中表達特征，結果表明：該基因在精巢中的精原細胞和初級精母細胞中有表達，在次級精母細胞中的表達量有所增加，而在精子細胞中幾乎不表達；在卵巢中，中華鱘dazl基因在卵原細胞和初級細胞中大量表達。

本發明制備了中華鱘dazl蛋白的特異性多克隆抗體。

本發明利用Western?Blot技術檢測中華鱘dazl蛋白在不同組織（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸、精巢、卵巢、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦）的表達特征，結果表明：dazl蛋白只在精巢和卵巢中表達。?

本發明利用免疫組化技術研究中華鱘dazl蛋白在精巢和卵巢中的表達特征，結果表明：在精巢中，dazl蛋白在精原細胞、初級精母細胞和次級精母細胞中有表達，而在精子細胞和精子中幾乎不見；卵巢中，dazl蛋白在卵原細胞和初級卵母細胞中大量表達。

本發明的積極效果為：本發明提供了中華鱘dazl基因的序列和不同組織中的其RNA和蛋白表達特征，鑒定了一種中華鱘生殖細胞標記基因。該基因可以應用于篩選和分離中華鱘生殖細胞，為中華鱘生殖細胞移植和種質資源保存等方面的應用研究奠定基礎。

附圖說明

圖1為Real-time?PCR檢測dazl基因在中華鱘不同組織中的表達特征；

圖2為dazl基因在中華鱘卵巢和精巢中的表達特征。A和B為卵巢，B為A中矩形區域的放大；C為精巢；og為卵原細胞，Ⅰ和Ⅱ為初級卵母細胞；SG為精原細胞，PSP為初級精母細胞，SSP為次級精母細胞，SPD為精子細胞；

圖3為dazl蛋白在中華鱘不同組織中的表達特征；

圖4為dazl蛋白在中華鱘卵巢和精巢中的表達特征。A、B和C為卵巢，D、E和F為精巢。A和D為中華鱘dazl蛋白抗體的免疫熒光定位，B和E為細胞核的熒光定位，C和F為兩種熒光的共定位。

具體實施方式

下面結合附圖1至4進一步說明本發明的具體實施方式。

1．總RNA的提取