[發明專利]F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍體細胞適應方法

無效

• 申請號: 201410007618.0
• 申請日: 2014-01-08
• 公開（公告）號: CN103756976A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 李黎;柳洪濤;張現臣;劉雨;孟紅彥;黃秋香;魏文進
• 申請（專利權）人: 北京民海生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/165;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍體細胞適應方法。

背景技術

流行性腮腺炎，簡稱腮腺炎或流腮，是由腮腺炎病毒所致的急性全身性傳染病。腮腺炎在世界范圍內流行，全年均可發病，以冬春季為主。任何年齡均可發病，以5～15歲患者居多，1歲以下和15歲以上很少發病。感染后一般可獲得終身免疫。感染潛伏期14～25日，平均18日。臨床特征為腮腺腫痛，可伴發熱、頭痛等。早期患者及隱性感染者均為傳染源。通過空氣飛沫或直接接觸唾液及唾液污染的食具玩具等傳播。MuV是腮腺炎的最常見的病因，可引起腦炎、睪丸炎、卵巢炎、無菌性腦膜炎、胰腺炎、心肌炎、乳腺炎、甲狀腺炎等。大多數嚴重并發癥在成人中較多見，青春期后男性患者中25％出現睪丸炎。有1-10％臨床腮腺炎患者出現輕型無菌性腦膜炎，腮腺炎腦膜炎可造成永久性后遺癥，包括癱瘓、癲瘸、顱神經麻痹、腦積水等。經發現，妊娠早期（3個月內）感染腮腺炎病毒的孕婦有25％會自然流產，其發生率高于風疹病毒感染。

在我國，盡管已在大范圍人群內使用了疫苗，但是近年來腮腺炎呈現一種高發的態勢，以衛生部公布的全國法定傳染病疫情為例，流行性腮腺炎連續幾年均高居全國丙類傳染病報告數的第二位。國際通用的Jeryl--Lynn株及我國使用的S79株減毒毒種均屬于流行于60年代后的A基因型，而當前我國流行的腮腺炎病毒株主要為F基因型。不同基因型之間的中和抗原會有一定差異，可能會導致不完全交叉性保護。我國近10年來腮腺炎減毒活疫苗納入免疫規劃，無償接種，但腮腺炎的發病率依然維持在較高水平。此外，目前我國常規使用的Jeryl-Lynn株及S79株減毒活疫苗均是以雞胚細胞為基質進行生產而來的。雞胚細胞（CEC）作為一種異源性細胞基質，可能帶來過敏反應；可能攜帶傳染性禽逆轉錄病毒；并且每批原代細胞質量不穩定，導致對同一個病毒靈敏度存在差異,影響產品的穩定性等不足。而使用人二倍體細胞進行腮腺炎減毒毒種的制備，不存在致腫瘤的潛在危險性；能夠充分鑒定和標準化；可實現細胞種子庫系統，有利于質量控制。

因而，通過在人二倍體細胞上對腮腺炎病毒進行適應性培養，從而分離及研究開發我國流行的腮腺炎病毒絕對優勢F基因型的代表株，開發我國本土疫苗毒株，對我國腮腺炎的防控具有重要的科學意義和實際應用價值。

發明內容

本發明的目的是提供F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍體細胞適應方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍體細胞適應方法，將人胚肺二倍體細胞MHL-3加入到預溫到36-37℃的MEM細胞培養液中，置于36-37℃培養，經2-3天長成單層細胞后接種F基因型腮腺炎病毒MHM-19株懸液，每75cm²培養瓶接種1mL病毒懸液，加入維持液，置于32-34℃培養，培養7-10天后，將細胞凍融三次，將病毒釋放到細胞上清液中，制成病毒懸液；按以上方法，將F基因型腮腺炎病毒MHM-19株連續在MHL-3細胞上傳代28次，獲得在MHL-3細胞上適應性好的F基因型腮腺炎病毒株MHM-19。其中，所述維持液為含有2%小牛血清的MEM細胞培養液。

優選地，將人胚肺二倍體細胞MHL-3加入到預溫到37℃的MEM細胞培養液中，置于37℃培養，經2-3天長成單層細胞后接種F基因型腮腺炎病毒MHM-19株懸液，每75cm²培養瓶接種1mL病毒懸液，加入20mL維持液，置于33℃培養，培養10天后，將細胞凍融三次，將病毒釋放到細胞上清液中，制成病毒懸液；按以上方法，將F基因型腮腺炎病毒MHM-19株連續在MHL-3細胞上傳代28次，獲得在MHL-3細胞上適應性好的F基因型腮腺炎病毒株MHM-19。

本發明還提供按照上述方法制備的F基因型腮腺炎病毒的二倍體細胞適應株MHM-19。

本發明還提供所述F基因型腮腺炎病毒的二倍體細胞適應株MHM-19在制備腮腺炎疫苗中的應用。

本發明還提供所述F基因型腮腺炎病毒的二倍體細胞適應株MHM-19在制備用于預防腮腺炎的藥物中的應用。

本發明中涉及的F基因型腮腺炎病毒MHM-19株的分離方法包括以下步驟：

a使用咽拭子采集腮腺炎急性感染患者口腔頰壁粘膜分泌物，懸于2mL?Hanks平衡鹽溶液中；

b將分離的咽拭子樣品經過0.22μm濾膜過濾除菌，并進行細胞培養物培養增殖，即為F基因型腮腺炎病毒株MHM-19。