[發(fā)明專(zhuān)利]F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍體細(xì)胞適應(yīng)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410007618.0
• 申請(qǐng)日: 2014-01-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103756976A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李黎;柳洪濤;張現(xiàn)臣;劉雨;孟紅彥;黃秋香;魏文進(jìn)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京民海生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N7/00
• 分類(lèi)號(hào): C12N7/00;A61K39/165;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍體細(xì)胞適應(yīng)方法。

背景技術(shù)

流行性腮腺炎，簡(jiǎn)稱(chēng)腮腺炎或流腮，是由腮腺炎病毒所致的急性全身性傳染病。腮腺炎在世界范圍內(nèi)流行，全年均可發(fā)病，以冬春季為主。任何年齡均可發(fā)病，以5～15歲患者居多，1歲以下和15歲以上很少發(fā)病。感染后一般可獲得終身免疫。感染潛伏期14～25日，平均18日。臨床特征為腮腺腫痛，可伴發(fā)熱、頭痛等。早期患者及隱性感染者均為傳染源。通過(guò)空氣飛沫或直接接觸唾液及唾液污染的食具玩具等傳播。MuV是腮腺炎的最常見(jiàn)的病因，可引起腦炎、睪丸炎、卵巢炎、無(wú)菌性腦膜炎、胰腺炎、心肌炎、乳腺炎、甲狀腺炎等。大多數(shù)嚴(yán)重并發(fā)癥在成人中較多見(jiàn)，青春期后男性患者中25％出現(xiàn)睪丸炎。有1-10％臨床腮腺炎患者出現(xiàn)輕型無(wú)菌性腦膜炎，腮腺炎腦膜炎可造成永久性后遺癥，包括癱瘓、癲瘸、顱神經(jīng)麻痹、腦積水等。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，妊娠早期（3個(gè)月內(nèi)）感染腮腺炎病毒的孕婦有25％會(huì)自然流產(chǎn)，其發(fā)生率高于風(fēng)疹病毒感染。

在我國(guó)，盡管已在大范圍人群內(nèi)使用了疫苗，但是近年來(lái)腮腺炎呈現(xiàn)一種高發(fā)的態(tài)勢(shì)，以衛(wèi)生部公布的全國(guó)法定傳染病疫情為例，流行性腮腺炎連續(xù)幾年均高居全國(guó)丙類(lèi)傳染病報(bào)告數(shù)的第二位。國(guó)際通用的Jeryl--Lynn株及我國(guó)使用的S79株減毒毒種均屬于流行于60年代后的A基因型，而當(dāng)前我國(guó)流行的腮腺炎病毒株主要為F基因型。不同基因型之間的中和抗原會(huì)有一定差異，可能會(huì)導(dǎo)致不完全交叉性保護(hù)。我國(guó)近10年來(lái)腮腺炎減毒活疫苗納入免疫規(guī)劃，無(wú)償接種，但腮腺炎的發(fā)病率依然維持在較高水平。此外，目前我國(guó)常規(guī)使用的Jeryl-Lynn株及S79株減毒活疫苗均是以雞胚細(xì)胞為基質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)而來(lái)的。雞胚細(xì)胞（CEC）作為一種異源性細(xì)胞基質(zhì)，可能帶來(lái)過(guò)敏反應(yīng)；可能攜帶傳染性禽逆轉(zhuǎn)錄病毒；并且每批原代細(xì)胞質(zhì)量不穩(wěn)定，導(dǎo)致對(duì)同一個(gè)病毒靈敏度存在差異,影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性等不足。而使用人二倍體細(xì)胞進(jìn)行腮腺炎減毒毒種的制備，不存在致腫瘤的潛在危險(xiǎn)性；能夠充分鑒定和標(biāo)準(zhǔn)化；可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞種子庫(kù)系統(tǒng)，有利于質(zhì)量控制。

因而，通過(guò)在人二倍體細(xì)胞上對(duì)腮腺炎病毒進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)，從而分離及研究開(kāi)發(fā)我國(guó)流行的腮腺炎病毒絕對(duì)優(yōu)勢(shì)F基因型的代表株，開(kāi)發(fā)我國(guó)本土疫苗毒株，對(duì)我國(guó)腮腺炎的防控具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍體細(xì)胞適應(yīng)方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍體細(xì)胞適應(yīng)方法，將人胚肺二倍體細(xì)胞MHL-3加入到預(yù)溫到36-37℃的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于36-37℃培養(yǎng)，經(jīng)2-3天長(zhǎng)成單層細(xì)胞后接種F基因型腮腺炎病毒MHM-19株懸液，每75cm²培養(yǎng)瓶接種1mL病毒懸液，加入維持液，置于32-34℃培養(yǎng)，培養(yǎng)7-10天后，將細(xì)胞凍融三次，將病毒釋放到細(xì)胞上清液中，制成病毒懸液；按以上方法，將F基因型腮腺炎病毒MHM-19株連續(xù)在MHL-3細(xì)胞上傳代28次，獲得在MHL-3細(xì)胞上適應(yīng)性好的F基因型腮腺炎病毒株MHM-19。其中，所述維持液為含有2%小牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液。

優(yōu)選地，將人胚肺二倍體細(xì)胞MHL-3加入到預(yù)溫到37℃的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃培養(yǎng)，經(jīng)2-3天長(zhǎng)成單層細(xì)胞后接種F基因型腮腺炎病毒MHM-19株懸液，每75cm²培養(yǎng)瓶接種1mL病毒懸液，加入20mL維持液，置于33℃培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后，將細(xì)胞凍融三次，將病毒釋放到細(xì)胞上清液中，制成病毒懸液；按以上方法，將F基因型腮腺炎病毒MHM-19株連續(xù)在MHL-3細(xì)胞上傳代28次，獲得在MHL-3細(xì)胞上適應(yīng)性好的F基因型腮腺炎病毒株MHM-19。

本發(fā)明還提供按照上述方法制備的F基因型腮腺炎病毒的二倍體細(xì)胞適應(yīng)株MHM-19。

本發(fā)明還提供所述F基因型腮腺炎病毒的二倍體細(xì)胞適應(yīng)株MHM-19在制備腮腺炎疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述F基因型腮腺炎病毒的二倍體細(xì)胞適應(yīng)株MHM-19在制備用于預(yù)防腮腺炎的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中涉及的F基因型腮腺炎病毒MHM-19株的分離方法包括以下步驟：

a使用咽拭子采集腮腺炎急性感染患者口腔頰壁粘膜分泌物，懸于2mL?Hanks平衡鹽溶液中；

b將分離的咽拭子樣品經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)增殖，即為F基因型腮腺炎病毒株MHM-19。