[發(fā)明專利]可控量子點(diǎn)位點(diǎn)特異性橋接偶聯(lián)的抗體標(biāo)記方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410003726.0
• 申請(qǐng)日: 2014-01-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103728447A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 殷俊;楊唐斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京晶泰美康生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/532
• 分類號(hào): G01N33/532;G01N21/64
• 代理公司: 北京康信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 吳貴明;張永明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種可控量子點(diǎn)位點(diǎn)特異性橋接偶聯(lián)的抗體標(biāo)記方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

量子點(diǎn)（Quantum?dot，QD）又稱半導(dǎo)體納米晶，是一種納米熒光材料，多呈球形，半徑小于或接近激子波爾半徑，直徑一般在1～12nm。量子點(diǎn)作為熒光材料具有優(yōu)異的熒光特性：擁有窄而對(duì)稱的熒光發(fā)射光譜，發(fā)射波長(zhǎng)隨材料及粒徑大小不同而不同，具有寬泛且連續(xù)的吸收光譜，斯托克斯位移較大，以上特性使量子點(diǎn)易于實(shí)現(xiàn)單波長(zhǎng)激發(fā)多波長(zhǎng)同時(shí)發(fā)射的多色標(biāo)記功能。此外，相對(duì)于有機(jī)熒光染料，量子點(diǎn)具有很好的光穩(wěn)定性，耐光漂白，熒光效率高等優(yōu)點(diǎn)，且隨著量子點(diǎn)表面配基化學(xué)修飾技術(shù)的發(fā)展，量子點(diǎn)生物相容性及標(biāo)記效率的進(jìn)一步提高，使得相關(guān)量子點(diǎn)生物標(biāo)記物在科研、檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用得到了進(jìn)一步拓展。

量子點(diǎn)探針標(biāo)記要實(shí)現(xiàn)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用，首先要解決量子點(diǎn)與生物活性分子高效偶聯(lián)的難題。其中可控、定向、定量是實(shí)現(xiàn)高效偶聯(lián)的基本原則。傳統(tǒng)的化學(xué)偶聯(lián)方法，是利用生物分子表面的化學(xué)基團(tuán)如蛋白表面的氨基或羧基等與量子點(diǎn)表面配基的活性基團(tuán)交聯(lián)。這種偶聯(lián)方式缺乏位點(diǎn)特異性，導(dǎo)致偶聯(lián)后生物分子活性下降、空間位阻、易聚沉等現(xiàn)象。取向性化學(xué)偶聯(lián)方法，利用生物分子表面特定的化學(xué)基團(tuán)如抗體的糖基等與量子點(diǎn)表面配基的活性基團(tuán)交聯(lián)。這種偶聯(lián)方式盡管改善了位點(diǎn)特異性，獲得了更高的偶聯(lián)效率，但操作步驟仍較繁瑣、條件難控制、易沉聚，不易重復(fù)，不能滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需要。此外使用化學(xué)偶聯(lián)方法，往往需要量子點(diǎn)表面配基帶有一定的活性基團(tuán)如羧基或氨基等，這些基團(tuán)通常容易與其它生物分子發(fā)生非特異結(jié)合而產(chǎn)生較高的背景信號(hào)，不利于高靈敏度檢測(cè)。而利用分子生物學(xué)技術(shù)，在抗體親和蛋白融合蛋白或合成的抗體結(jié)合肽基礎(chǔ)上，加入利于交聯(lián)的標(biāo)簽如半胱氨酸標(biāo)簽、組氨酸標(biāo)簽或生物素標(biāo)簽，獲得抗體親和配體，與表面含金屬離子或親和素修飾的量子點(diǎn)直接混合，即可實(shí)現(xiàn)蛋白與量子點(diǎn)高效、位點(diǎn)特異性自組裝偶聯(lián)。當(dāng)利用金屬配位偶聯(lián)時(shí)，量子點(diǎn)表面可使用惰性配基修飾降低背景信號(hào)提高靈敏度。與采用分子生物學(xué)手段對(duì)每種目標(biāo)蛋白分別進(jìn)行遺傳操作不同，此方法適用于通用型免疫活性量子點(diǎn)探針的快速標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種可控量子點(diǎn)位點(diǎn)特異性橋接偶聯(lián)的抗體標(biāo)記方法及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中抗體與量子點(diǎn)偶聯(lián)缺乏位點(diǎn)特異性或操作步驟繁瑣且不能滿足規(guī)模化生產(chǎn)需要的技術(shù)問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種可控量子點(diǎn)位點(diǎn)特異性橋接偶聯(lián)的抗體標(biāo)記方法。該方法包括以下步驟：在量子點(diǎn)表面上偶聯(lián)抗體親和配體；以及以抗體親和配體作為橋接分子與抗體進(jìn)行位點(diǎn)特異性自組裝標(biāo)記，其中，抗體親和配體包括用于與抗體結(jié)合的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列、用于與量子點(diǎn)表面偶聯(lián)的標(biāo)簽序列以及提供抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽序列與標(biāo)簽序列之間空間間隔的間隔臂序列。

進(jìn)一步地，抗體親和蛋白序列為蛋白G、蛋白A、蛋白A/G或蛋白L；抗體結(jié)合肽序列為六肽HWRGWV。

進(jìn)一步地，標(biāo)簽序列包括含有4～12個(gè)組氨酸的組氨酸標(biāo)簽、含有1～5個(gè)半胱氨酸的半胱氨酸標(biāo)簽或含有生物素修飾的標(biāo)簽。

進(jìn)一步地，量子點(diǎn)表面帶有供與標(biāo)簽序列連接的標(biāo)簽序列配體。

進(jìn)一步地，配體包括配位金屬離子或親和素蛋白。

進(jìn)一步地，抗體源自大鼠、小鼠、兔、羊、馬、豬、牛或人。

進(jìn)一步地，抗體包括通過(guò)免疫兔、羊、或鼠等動(dòng)物產(chǎn)生的多抗、雜交瘤方法制備的單抗、異源表達(dá)的單抗或基因工程抗體。

進(jìn)一步地，通過(guò)調(diào)節(jié)抗體的濃度控制抗體與抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽的連接數(shù)量，并用酶解的抗體片段封閉未結(jié)合抗體的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽的結(jié)合位點(diǎn)。

進(jìn)一步地，抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽與量子點(diǎn)偶聯(lián)摩爾比為1～200：1。

進(jìn)一步地，抗體與量子點(diǎn)偶聯(lián)摩爾比為0.5～100：1。

本發(fā)明還可提供一種可控量子點(diǎn)位點(diǎn)特異性橋接偶聯(lián)的標(biāo)記抗體在酶聯(lián)免疫吸附、側(cè)向免疫層析、細(xì)胞成像、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白印跡中的應(yīng)用。

應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，用帶標(biāo)簽序列和間隔臂序列的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽作為橋接分子偶聯(lián)量子點(diǎn)與抗體，連接方式簡(jiǎn)單、快速、可控且位點(diǎn)特異性好，偶聯(lián)產(chǎn)物在大多數(shù)生物檢測(cè)環(huán)境條件下穩(wěn)定，且不必對(duì)所獲得的抗體采取任何化學(xué)修飾或改造，只要其保守區(qū)與特定的抗體親和蛋白或抗體結(jié)合肽有特異結(jié)合能力就可以進(jìn)行自組裝偶聯(lián)，適用范圍廣，大大簡(jiǎn)化了量子點(diǎn)與不同抗體偶聯(lián)的過(guò)程，利于系列抗體標(biāo)記物的快速生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明