[發(fā)明專利]水稻金屬硫蛋白基因OsMT-1-2a的原核表達(dá)載體及其應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410002981.3 | 申請(qǐng)日： | 2014-02-14 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN103740746A | 公開（公告）日： | 2014-04-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 胡麗芳;賀浩華;劉世強(qiáng);朱昌蘭;邊建民;彭小松;賀曉鵬;傅軍如;陳小榮;歐陽林娟 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N15/70 | 分類號(hào)： | C12N15/70;C12N15/82 |
| 代理公司： | 南昌洪達(dá)專利事務(wù)所 36111 | 代理人： | 劉凌峰 |
| 地址： | 330045 江西省南*** | 國省代碼： | 江西;36 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 水稻 金屬 蛋白 基因 osmt 表達(dá) 載體 及其 應(yīng)用 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
???本發(fā)明涉及水稻金屬硫蛋白基因OsMT-1-2a的原核表達(dá)載體及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。?
背景技術(shù)
???植物的生長發(fā)育需要合適的外在條件，當(dāng)溫度、濕度、水分、鹽濃度等發(fā)生急劇變化，或大氣污染、紫外線輻射、農(nóng)藥及病原體等作用于植物時(shí)，會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive?Oxygen?Species，ROS)，導(dǎo)致氧化脅迫反應(yīng)。?
???植物體內(nèi)有效清除活性氧的保護(hù)機(jī)制分為酶促和非酶促系統(tǒng)。酶促系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和過氧化物酶(POD)等。非酶類系統(tǒng)包括抗壞血酸、谷胱甘肽、甘露醇和類黃酮等抗氧化劑。?
???大量的研究表明，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗氧化機(jī)制可增加植物抗活性氧的能力，SOD、APX、CAT、GR、DHAR、GST和GPX的過量表達(dá)可有效清除植株體內(nèi)的ROS水平，從而提高多種作物對(duì)非生物脅迫的抗性。?
???金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白。植物金屬硫蛋白由于其具有結(jié)合重金屬離子(如Cu2?+、Zn2?+、Cd2?+、Pb2?+等)?的能力，因此被認(rèn)為在解除重金屬離子毒害使植物免受氧化損傷方面起重要作用。?
???MT除對(duì)重金屬具有解毒作用外，其在ROS的清除中也發(fā)揮著一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜中CLMT2對(duì)羥自由基的清除能力非常顯著，棉花GhMT3a過表達(dá)植株不易遭受氧化脅迫，對(duì)雙氧水和羥自由基具有明顯的清除效果，水稻OsMT2b的RNAi植株會(huì)出現(xiàn)ROS水平異常累積，表皮細(xì)胞不正常死亡,?體外表達(dá)的水稻OsMT-1-4b重組蛋白具有明顯清除氧羥自由基和超氧根離子能力。?
???水稻基因組中共有11個(gè)金屬硫蛋白基因，除OsMT2b和OsMT-1-4b外，其它9個(gè)OsMT基因否具有ROS清除能力并不清楚，我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在水稻ROS累積的突變體Osmad3中，與OsMT-1-4b相似，另一個(gè)金屬硫蛋白基因OsMT-1-2a（Os0101g49800）的表達(dá)量也明顯下降，但是否具有清除ROS的能力并不清楚。?
???進(jìn)一步通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)OsMT-1-2a在ROS清除中的作用后，可利用基因工程的策略來提高OsMT-1-2a在植物體內(nèi)的活性水平以此來提高植物的抗逆性。?
發(fā)明內(nèi)容
???本發(fā)明的目的在于提供水稻金屬硫蛋白基因OsMT-1-2a的原核表達(dá)載體，一種能產(chǎn)生金屬硫蛋白的原核表達(dá)載體，該載體含有水稻OsMT-1-2a蛋白基因、T7啟動(dòng)子和終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS、His標(biāo)簽，OsMT-1-2a基因的上游為啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列。?
??本發(fā)明的另一目的是將水稻金屬硫蛋白基因OsMT-1-2a的原核表達(dá)載體Pet-32A-OsMT-1-2a應(yīng)用于清除氧羥自由基和超氧根離子。?
??為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：?
1、水稻金屬硫蛋白基因OsMT-1-2a的原核表達(dá)載體的構(gòu)建：
1）根據(jù)GenBank上發(fā)表的OsMT-1-2a全長基因序列，設(shè)計(jì)如下特異性引物：
OsMT-1-2a-5’：?GAATTCatgtcgtgctgcggaggaaactg
OsMT-1-2a-3’：?CTCGAGcttgccgcagttgcaggggttgc
????引物OsMT-1-2a-5’含有限制性內(nèi)切酶EcoR?I識(shí)別位點(diǎn)，OsMT-1-2a-3’含有限制性內(nèi)切酶Xho?I識(shí)別位點(diǎn)；
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