[發(fā)明專利]一種優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI及其表達(dá)方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410001201.3
• 申請日: 2014-01-02
• 公開（公告）號: CN103740730A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫同毅
• 申請（專利權(quán)）人: 濰坊醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12N15/15
• 分類號: C12N15/15;C12N15/70;C07K14/81;A61K38/57;A61P1/18;A61P7/04
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.一種優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI，其具有序列表SEQ?ID?NO:1的核苷酸序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI，其特征在于克隆所述基因的特異性引物為：

引物F1：5’-ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’；

引物R1：5’-ACGCGGCCGCTTAACCACCACCACCACCAA-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI，其特征在于在所述OH-TCI基因的5’端加有SmaI酶切位點(diǎn)，3’端加有HandIII酶切位點(diǎn)。

4.權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI編碼產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑OH-TCI，其具有序列表SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列。

5.含有權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI的重組載體。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pUC18-OH-TCI和pET43.1-OH-TCI。

7.權(quán)利要求4所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI的表達(dá)方法，其特征在于它包括以下步驟：將所述的OH-TCI基因與pUC18-T載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中獲得重組質(zhì)粒pUC18-OH-TCI，以pUC18-OH-TCI為模板，用F1、R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段OH-TCI，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET43.1-OH-TCI并將其轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21中，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，將陽性轉(zhuǎn)化子接種于液體培養(yǎng)基中，將菌株按2%接種量接入LB培養(yǎng)基中，于37℃，210?r/min搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀值達(dá)到0.5-0.6時(shí)，加IPTG，28℃溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體細(xì)胞，純化融合蛋白NusA-OH-TCl，用thrombin酶切融合蛋白得到重組蛋白酶抑制劑rOH-TCl。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI在制備治療急性胰腺炎和減少術(shù)中的出血量的藥物或保健品中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI在制備治療急性胰腺炎和減少術(shù)中的出血量的藥物或保健品中的應(yīng)用，其特征在于所述眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI具有對胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性。