[發(fā)明專(zhuān)利]一種昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410001003.7
• 申請(qǐng)日: 2014-01-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103759994A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李永麗;周洲;源春彥;李紅英;劉圣明
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 河南科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N1/28
• 分類(lèi)號(hào): G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛(ài)周

1.一種昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）組織固定：

取昆蟲(chóng)蟲(chóng)體浸于組織固定液中，抽真空并保持負(fù)壓10～30分鐘，再于4℃下靜置10～14小時(shí)；

（2）組織脫水：

取組織固定后的蟲(chóng)體，4℃條件下，依次用濃度梯度為50%、60%、70%、90%、100%的乙醇溶液脫水，每個(gè)梯度的處理時(shí)間至少為1小時(shí)；

（3）組織透明：

取組織脫水后的蟲(chóng)體，室溫下在組織透明劑中浸泡5～9小時(shí)；

（4）浸蠟、包埋與切片：

取組織透明后的蟲(chóng)體，在65℃的液體石蠟中浸泡7～9小時(shí)，凝固定型后切片；

（5）展片與粘片：

取切片移至載玻片上，在切片邊緣滴加60℃的蒸餾水至切片完全展開(kāi)，再置于30～37℃條件下10～14小時(shí)粘片；

（6）脫蠟和組織復(fù)水：

取組織透明劑滴加在切片組織上，保持至少20分鐘后吸走，重復(fù)至少3次，再依次滴加濃度梯度為100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水，每個(gè)梯度的處理時(shí)間為1～5分鐘。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：所述步驟（1）中的組織固定液為：取100mL?PBS緩沖液，調(diào)節(jié)緩沖液pH值至10.5～11.5，加熱至65～75℃，加入多聚甲醛至終濃度為4%，待溶解完全后冷卻，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5～7.5，再加入30μL吐溫-20或吐溫X-100，冷卻至4℃?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：所述的的PBS緩沖液的組成為：NaCl?137mmol/L，KCl?2.7mmol/L，Na₂HPO₄?10mmol/L，KH₂PO₄?2mmol/L，pH值為5～7。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：所述步驟（1）中負(fù)壓的壓力值為-1.0KPa。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：所述步驟（2）中組織脫水步驟為：

1）4℃條件下，50%乙醇中保持1h，

2）4℃條件下，60%乙醇中保持1h，

3）4℃條件下，70%乙醇中保持1h，

4）4℃條件下，90%乙醇中保持1h，

5）4℃條件下，無(wú)水乙醇中保持1h，

6）4℃條件下，無(wú)水乙醇中保持1h，

7）4℃條件下，無(wú)水乙醇中保持1h。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：所述步驟（2）中乙醇用量與蟲(chóng)體的體積比為20:1。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：所述步驟（3）中組織透明步驟為：

1）室溫條件下，組織透明劑中浸泡1.5～2小時(shí)；

2）室溫條件下，組織透明劑中浸泡1.5～2小時(shí)；

3）室溫條件下，組織透明劑中浸泡2～3小時(shí)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：所述的組織透明劑為Histo-Clear。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：所述步驟（4）中浸蠟步驟為：

1）浸入液體石蠟，65℃浸泡2小時(shí)，

2）浸入液體石蠟，65℃浸泡2小時(shí)，

3）浸入液體石蠟，65℃浸泡2小時(shí)，

4）浸入液體石蠟，65℃浸泡2小時(shí)。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)石蠟切片方法，其特征在于：所述步驟（6）中脫蠟和組織復(fù)水步驟為：

1）將組織透明劑滴加在切片組織上，保持20min后吸走，

2）將組織透明劑滴加在切片組織上，保持20min后吸走，

3）將組織透明劑滴加在切片組織上，保持20min后吸走，

4）將無(wú)水乙醇滴加在切片組織上，保持1min后吸走，

5）將無(wú)水乙醇滴加在切片組織上，保持1min后吸走，

6）將95%乙醇滴加在切片組織上，保持1min后吸走，

7）將85%乙醇滴加在切片組織上，保持1min后吸走，

8）將70%乙醇滴加在切片組織上，保持1min后吸走，

9）將50%乙醇滴加在切片組織上，保持1min后吸走，

10）將30%乙醇滴加在切片組織上，保持1min后吸走，

11）將無(wú)菌水滴加在切片組織上，保持1min后吸走。