[發明專利]用于測量由于非金屬化學污染物導致的環境樣品中一般毒性及一般毒性的量的體外測試

在審

• 申請號: 201380078489.8
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN105658808A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 特里福內·斯凱蒂諾;馬里亞·久利亞·廖內托;伊利莎·埃羅伊
• 申請（專利權）人: 薩蘭托大學
• 主分類號: C12Q1/527
• 分類號: C12Q1/527;G01N33/68
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 張英;宮傳芝

1.一種用于評價環境樣品的毒性的方法，包括以下步驟：

a)將水性緩沖液與酶碳酸酐酶的水溶液混合；

b)將包含二氧化碳(CO₂)或碳酸氫鹽(HCO₃^-)的水溶液 添加至步驟(a)中獲得的混合物以開始所述碳酸酐酶酶反應；

c)通過評價步驟(b)中獲得的所述混合物隨時間的pH變 化測定所述碳酸酐酶的酶活性，所述pH變化是由碳酸酐酶催化的 CO₂的水合反應或HCO₃^-的反向脫水反應的指示物；

d)在其中沒有添加碳酸酐酶的水溶液的步驟(a)的所述緩 沖液上重復步驟(b)和(c)的步驟以測量非特異活性；

e)在步驟(a)獲得的所述混合物中重復步驟(b)和(c) 的步驟，其中，所述溶液包含已經提前與待評價其毒性的所述環境 樣品預培養的碳酸酐酶；

f)計算碳酸酐酶的抑制值(I)作為(i)和(ii)之間的百分比， 其中，(i)是在步驟(e)中測得的碳酸酐酶的所述酶活性與在步 驟(d)中測得的非特異活性之間的差值，以及(ii)是在步驟(c) 中測得的碳酸酐酶的所述酶活性與在步驟(d)中測得的非特異活性 之間的差值。

2.根據權利要求1所述的方法，其中：

將重金屬螯合劑進一步添加至在步驟(a)中制備的水性緩沖液 和碳酸酐酶的水溶液的混合物；以及

在步驟(e)之后是步驟(f')，其中，碳酸酐酶的抑制值在螯 合劑(Ichel)的存在下計算為(iii)和(iv)之間的百分比，其中， (iii)是在螯合劑存在下發生的步驟(e)中測得的碳酸酐酶的所述 酶活性與在螯合劑存在下發生的步驟(d)中測得的所述非特異活性 之間的差值以及(iv)是在螯合劑存在下在步驟(c)中測得的所述 碳酸酐酶的所述酶活性與在螯合劑的存在下在步驟(d)中測得的所 述非特異活性之間的差值。

3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述重金屬螯合劑選自由EGTA (乙二醇四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、BAPTA(1,2-雙(鄰- 氨基苯氧基)乙酸)和DTPA(二乙烯三胺五乙酸)組成的組。

4.根據前述權利要求中一項或多項所述的方法，其中，步驟(c)和(e) 中碳酸酐酶的所述酶活性通過測量步驟(b)中獲得的所述混合物中 隨時間變化的pH的初始速率進行評價。

5.根據前述權利要求中一項或多項所述的方法，其中，所述混合物中 CO₂的濃度是包括在100至200mg/l之間，所述混合物是將步驟(b) 中提及的所述水溶液添加至步驟(a)中制備的所述混合物的結果。

6.根據權利要求1-4中一項或多項所述的方法，其中，所述混合物中 碳酸氫鹽的濃度包括在5至15mM之間，所述混合物是將步驟(b) 中提及的所述水溶液添加至步驟(a)中制備的所述混合物的結果。

7.根據前述權利要求中一項或多項所述的方法，其中，所述碳酸酐酶 是人類來源的。

8.根據前述權利要求中一項或多項所述的方法，其中，步驟(a)的所 述水性緩沖液包含濃度包括在3至10mM之間的2-氨基-2-羥甲基- 丙烷-1,3-二醇(Tris)或4-2-羥乙基-1-哌嗪基-乙磺酸(HEPES)。

9.根據前述權利要求中一項或多項所述的方法，其中，包含碳酸酐酶 的所述溶液與步驟(e)中的所述環境樣品孵育小于30分鐘的時間。

10.根據前述權利要求中一項或多項所述的方法，其中，在包括0℃至 10℃之間的溫度下進行步驟(b)、(c)、(d)和(e)。

11.根據前述權利要求中一項或多項所述的方法，其中，隨時間的pH 變化的評價通過pH變化的比色指示物電測量地或比色地進行。

12.根據權利要求11所述的方法，其中，pH變化的所述比色指示物是 中性紅(3-氨基-7-二甲基胺基-2-甲基吩嗪氯化氫)。