[發(fā)明專利]產(chǎn)L-異亮氨酸微生物和使用該微生物生產(chǎn)L-異亮氨酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380077311.1
• 申請(qǐng)日: 2013-06-11
• 公開（公告）號(hào): CN105378059B
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金蕙園;李智惠;金宗賢;李翰衡;全愛智
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: CJ第一制糖株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P13/06
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民;張全信

本發(fā)明涉及具有生產(chǎn)L?異亮氨酸的增強(qiáng)能力的微生物和使用該微生物生產(chǎn)L?異亮氨酸的方法。更具體地，本發(fā)明涉及谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變菌株，其耐受L?異亮氨酸和L?蘇氨酸衍生物并具有生產(chǎn)L?異亮氨酸的增強(qiáng)的能力，并且涉及使用突變菌株生產(chǎn)L?異亮氨酸的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有生產(chǎn)L-異亮氨酸的增強(qiáng)能力的微生物，并且涉及使用該微生物生產(chǎn)L-異亮氨酸的方法。

背景技術(shù)

L-氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單元，并且被廣泛地用作動(dòng)物的功能性食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)源，并且被廣泛地用于制藥工業(yè)。在20種氨基酸中，支鏈氨基酸由3個(gè)結(jié)構(gòu)單元(member)——L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸——組成，并且其工業(yè)價(jià)值正逐步增加。據(jù)報(bào)道，支鏈氨基酸在維持和形成人骨骼肌、和行使調(diào)節(jié)胰島素的功能、以及維持和增加肌肉質(zhì)量方面起到重要作用(Andrea tom等，(2006)The journal of nutrition,136,324s-330s)。特別地，L-異亮氨酸在肌肉中代謝以產(chǎn)生能量，并且參與血紅蛋白生產(chǎn)，并且減輕疲勞和促進(jìn)生長(zhǎng)。因而，它用于多種應(yīng)用，其包括可注射流體和營(yíng)養(yǎng)物，并且它在運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中的應(yīng)用也正與日俱增。

為了工業(yè)化生產(chǎn)L-異亮氨酸，谷氨酸棒狀桿菌被用作代表性微生物。此微生物從作為前體的丙酮酸和2-丁酮酸經(jīng)由三種中間代謝物生產(chǎn)L-異亮氨酸(見圖1)。從兩種前體合成2-乙酰基-2-羥基丁酸，并且由此合成2,3-二羥基-3-甲基戊酸酯和2-酮基-3-甲基戊酸酯，并且最終產(chǎn)生L-異亮氨酸。使用酶——乙酰羥酸合酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶(isomeroreductase)、二羥酸脫水酶和轉(zhuǎn)氨酶——來(lái)生產(chǎn)每一個(gè)代謝物(Jin Hwan Park等，Appl microbial biotechnol,(2010)85:491-506)。

在谷氨酸棒狀桿菌菌株中，在L-異亮氨酸生物合成步驟中重要的乙酰羥酸合酶是由ilvBN基因編碼的，并且經(jīng)受最終產(chǎn)物L(fēng)-異亮氨酸的反饋抑制，使得基因的表達(dá)和酶的活性被抑制。另外，產(chǎn)生2-丁酮酸的蘇氨酸脫氫酶也經(jīng)受L-異亮氨酸的反饋抑制。因而，已知的是，參與L-異亮氨酸生物合成的基因表達(dá)和酶活性的調(diào)控對(duì)生成以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株是關(guān)鍵的(Jin hwan park等，Biotechnology journal,(2010)560-577)。另外，如圖1中可見，通過(guò)相同的生物合成途徑生產(chǎn)L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸。因而，為了大量生產(chǎn)L-異亮氨酸，應(yīng)該充分地供應(yīng)用作2-丁酮酸前體的L-蘇氨酸，使得可以減少其它支鏈氨基酸的產(chǎn)生，并且可以持續(xù)地產(chǎn)生L-異亮氨酸。在解決此問(wèn)題的嘗試中，據(jù)報(bào)道，α-氨基-β-羥基正纈氨酸和L-蘇氨酸衍生物可以用于增加L-蘇氨酸的生產(chǎn)(Cayo Ramos等，Applied and environmental microbiology,(1992)1677-1682)。進(jìn)一步，報(bào)道了將L-異亮氨酸生產(chǎn)能力賦予至具有生產(chǎn)L-蘇氨酸的能力的微生物的方法(韓國(guó)專利特開公布號(hào)2011-0058731)，同時(shí)至生產(chǎn)L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的微生物的方法(韓國(guó)專利特開公布號(hào)2002-0013777)等等。同樣，據(jù)報(bào)道，4-硫雜異亮氨酸(thiaisoleucine)——一種異亮氨酸衍生物的使用抑制了蘇氨酸脫水酶的反饋(John J.Wasmuth,Journal of bacteriology,(1973)562-570)。而且，據(jù)報(bào)道，對(duì)異亮氨酸-異羥肟酸耐受的突變菌株具有生產(chǎn)L-異亮氨酸的增強(qiáng)的能力(M.Kisumi,Journal of general microbiology,(1971)69291-297)。另外，有AHAS的研究與開發(fā)方法的報(bào)道，所述方法包括使產(chǎn)L-異亮氨酸菌株突變以與L-纈氨酸的生產(chǎn)相比增加L-異亮氨酸的生產(chǎn)(韓國(guó)專利特開公布號(hào)2011-0061780)，并且有集中于通過(guò)改變發(fā)酵期間的氧供應(yīng)或自然條件比如pH來(lái)增加L-異亮氨酸的產(chǎn)量的研究的報(bào)道(Zhihian Peng等，Bioprocess biosyst eng,(2010)33:339-345)。