[發明專利]將dsRNA引入植物種子以調節基因表達的方法

有效

• 申請號: 201380074217.0
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN105358695B
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: A.阿夫尼伊;E.里多-尼里;R.毛爾;O.梅爾;O.奈維特-布里克
• 申請（專利權）人: A.B.種子有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01N63/02;A01H3/04;A01H5/10;A01H6/46;A01H6/82
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 羅文鋒;彭昶

1.用于產生具有昆蟲抗性的植物的方法，所述方法包括：a) 將未萌發的分離的種子浸泡在包含不可轉錄的dsRNA分子的溶液中，所述dsRNA分子含有包含呈反義或有義方向的害蟲基因的18或更多個連續核苷酸的至少一個區段的至少一個多核苷酸鏈，其中在所述溶液中振蕩所述未萌發的分離的種子達至多24小時，和b) 使分離的種子萌發以產生自分離的種子顯現后表現出昆蟲抗性的植物。

2.權利要求1的方法，其中在自分離的種子顯現后所述植物不包含可檢測水平的所述dsRNA分子。

3.權利要求1的方法，其中所述害蟲基因選自ATP酶、NADPH細胞色素P450氧化還原酶、IAP、殼多糖合酶、EF1α和β-肌動蛋白。

4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述植物對棉貪夜蛾、玉米幼芽根葉甲或馬鈴薯甲蟲侵染具有抗性。

5.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述不可轉錄的dsRNA分子與內源植物基因在至少25個連續bp上具有至少80%同一性。

6.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述方法進一步包括在引入不可轉錄的dsRNA分子之前引發分離的種子。

7.權利要求6的方法，其中所述引發如下實行：

(i) 在引入不可轉錄的dsRNA分子之前洗滌分離的種子；和

(ii) 在步驟(i)之后干燥分離的種子。

8.處理分離的種子以改良自分離的種子長出的植物的昆蟲抗性的方法，所述方法包括：將未萌發的分離的種子浸泡在包含含有以下序列的外源dsRNA分子的溶液中：所述序列與害蟲基因或自所述害蟲基因轉錄的RNA序列的至少18個連續核苷酸基本相同或與其基本互補，其中在所述溶液中振蕩所述未萌發的分離的種子達至多24小時，并且其中相比對照植物，所述自所述未萌發的分離的種子長出的植物表現出改良的昆蟲抗性，以及其中在萌發后所述dsRNA存在于植物中至少10天。

9.權利要求8的方法，其中所述方法進一步包括在引入外源dsRNA分子之前引發分離的種子。

10.權利要求9的方法，其中所述引發如下實行：

(i) 在引入外源dsRNA分子之前洗滌分離的種子；和

(ii) 在步驟(i)之后干燥分離的種子。

11.權利要求10的方法，其中在雙重去離子水存在下實行洗滌。

12.權利要求10的方法，其中實行洗滌2-6小時。

13.權利要求10的方法，其中洗滌在4-28℃下實行。

14.權利要求10的方法，其中干燥在25-30℃下實行10-16小時。

15.權利要求8的方法，其中在20-150 μg/ml濃度的外源dsRNA分子存在下實行引入。

16.權利要求8的方法，其中在包含0.1 mM EDTA的溶液中將所述外源dsRNA分子引入分離的種子。

17.權利要求8的方法，其中在物理作用劑存在下實行外源dsRNA分子的引入。

18.權利要求17的方法，其中所述物理作用劑是PEG-修飾的碳納米管。